المناعية مضان الفحص من البروتينات السطحية المعرضة للالبريميات
Summary
وصفت وسيلة فعالة لتقييم التعرض سطح البروتينات البريميات. وهو مصمم خصيصا لطريقة لتجنب اضطراب الغشاء الخارجي للخلايا هشة البريميات. هذا الأسلوب يتطلب العمل من الضوابط سلبية عديدة لتقييم سلامة الغشاء الخارجي ونوعية رد فعل الأجسام المضادة.
Abstract
وتشارك البروتينات السطحية الجرثومي في اتصال مباشر مع الخلايا المضيفة وامتصاص المغذيات من البيئة 1. لهذا السبب ، لا يمكن توطين الخلوية توفير نظرة ثاقبة لدور وظيفي من البروتينات البكتيرية. توطين سطح البروتينات البكتيرية هي خطوة مهمة نحو تحديد عوامل الفوعة تشارك في آليات المرضية.
قد طرق تجزئة البريميات الأغشية 2-5 تكون انتقائية لفئة معينة من الغشاء الخارجي ، البروتينات (خطط إدارة المكاتب) ، مثل البروتينات الدهنية عبر الغشاء مقابل خطط إدارة المكاتب ، وتؤدي بالتالي إلى الخطأ في التصنيف. هذا هو الأرجح بسبب الاختلافات الهيكلية ، وكيف أنها ترتبط إلى الغشاء الخارجي. وترتبط مع البروتينات الدهنية الأغشية عن طريق التفاعل بين مسعور شاردة الدهن N – الطرفي (ثلاثة أحماض الدهنية) ، والدهون الفوسفاتية طبقة ثنائية الدهن 6 ، 7. في المقابل ، عادة ما يتم دمج خطط إدارة المكاتب عبر الغشاء في طبقة ثنائية المادة الدهنية التي متقابلة الزمر β – ترتيب الأوراق في بنية برميل مثل 8 و 9. بالإضافة إلى ذلك ، وجود بروتين في الغشاء الخارجي ، لا يضمن بالضرورة أن يتعرض للبروتين أو المجالات على السطح. ومن المعروف الأغشية الخارجي ملتوياتي أن تكون أساليب هشة ، وبالتالي تنطوي على تلاعب لطيف تتطلب من الخلايا وإدراج الفرعي سطح البروتين ضوابط لتقييم سلامة الغشاء الخارجي.
هنا ، ونحن تقديم مقايسة التألق المناعي (IFA) طريقة لتقييم التعرض مباشرة على سطح البروتينات leptospires سليمة. ويستند هذا الأسلوب على الاعتراف البروتينات السطحية البريميات بواسطة أضداد المستضد محددة. هنا ، هي أجسام مضادة محددة لdetetcted OmpL54 10 aftero ملزمة لأصلي الحواتم السطح ، وعرضة للخطر. مقارنة تفاعل الأجسام المضادة لخلايا سليمة مقابل permeabilized تمكن تقييم توزيع الخلوية وجود أو عدم وجود البروتين بشكل انتقائي على سطح البريميات. وينبغي تقييم سلامة الغشاء الخارجي باستخدام أجسام مضادة لبروتين واحد أو أكثر تحت سطح الأرض ، وتقع يفضل أن تكون في الجبلة المحيطية.
ويمكن استخدام أسلوب تحليل ايفا سطح سطح التعرض لأي بروتين البريميات التي أضداد محددة متاحة. كلا من فائدة والحد من الأسلوب يعتمد على ما إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة قادرة على ربط الحواتم الأصلي. ربما منذ الأضداد غالبا ما تثار ضد بروتينات المؤتلف ، الحواتم الأصلي من البروتينات السطحية المعرضة لل، لا يمكن الاعتراف بها. ومع ذلك ، فإن الأسلوب ايفا السطح هو أداة قيمة لدراسة مكونات الأسطح البكتيرية سليمة. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب ليس فقط ولكن أيضا لleptospires اللولبيات الأخرى والبكتيريا سالبة الجرام. أقوى الاستنتاجات المتعلقة سطح التعرض للخطط إدارة المكاتب ، فمن المستحسن اتباع نهج شامل تشترك فيه عدة طرق توطين الخلية 10.
Protocol
Discussion
أسلوبنا ايفا سطح مماثلة لتلك التي تستخدم للتدليل على سطح التعرض borrelial مختلفة 15 و 16 و البريميات 12 و 17 من البروتينات. وصف تفاصيل السطح ايفا الأسلوب هنا صممت للحد من التلاعب في الخلايا وذلك في محاولة للحفاظ على سلامة الغشاء الخارجي مع الاستفادة من اتجاه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل دائرة الصحة العامة منحة AI – 34431 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وزارة شؤون المحاربين القدامى صناديق البحوث الطبية (لداه).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
