Immuno-fluorescenza saggio di Leptospiral superficie esposti Proteine
Summary
Un metodo efficace per valutare l'esposizione superficiale di proteine leptospiral è descritto. Il metodo è specificamente progettato per evitare l'interruzione della membrana esterna delle cellule fragili leptospiral. Questa tecnica richiede l'impiego di diversi controlli negativi per valutare l'integrità della membrana esterna e la specificità della reazione anticorpale.
Abstract
Proteine della superficie batterica sono coinvolti in contatto diretto con le cellule ospiti e l'assorbimento delle sostanze nutritive dall'ambiente 1. Per questo motivo, localizzazione cellulare in grado di fornire intuizioni sul ruolo funzionale delle proteine batteriche. Localizzazione superficiale delle proteine batteriche è un passo fondamentale verso l'identificazione dei fattori di virulenza coinvolti nei meccanismi di patogenicità.
Metodi per frazionamento leptospiral 2-5 membrane può essere selettivo per una certa classe di proteine di membrana esterna (OMP), come lipoproteine vs OMP transmembrana, e quindi portare a errata classificazione. Questo probabilmente è dovuto a differenze strutturali e come essi sono associati alla membrana esterna. Le lipoproteine sono associati alle membrane attraverso una interazione idrofobica tra N-terminale porzione lipidica (tre acidi grassi) e dei fosfolipidi doppio strato lipidico 6, 7. Al contrario, OMP transmembrana sono tipicamente integrate nel doppio strato lipidico da anfipatiche β-fogli disposti in una botte struttura simile 8, 9. Inoltre, la presenza di una proteina nella membrana esterna non garantisce necessariamente che la proteina oi suoi domini sono esposte sulla superficie. Spirochete membrane esterne sono noti per essere i metodi fragile e occorre, pertanto coinvolgono la manipolazione dolce delle cellule e l'inclusione di sub-superficie proteina controlli per valutare l'integrità della membrana esterna.
Qui, presentiamo una immunofluorescenza saggio (IFA) per valutare direttamente l'esposizione di proteine sulla superficie leptospire intatto. Questo metodo si basa sul riconoscimento delle proteine di superficie leptospiral da antigene-anticorpi specifici. Qui, gli anticorpi specifici per OmpL54 10 sono detetcted aftero vincolanti per natale, epitopi superficie esposta. Confronto di reattività anticorpi contro le cellule intatte permeabilizzate consente la valutazione della distribuzione cellulare e se non è selettivo una proteina presente sulla superficie leptospiral. L'integrità della membrana esterna deve essere valutato utilizzando anticorpi ad una o più proteine del sottosuolo, preferibilmente situato nel periplasma.
Il metodo IFA superficie può essere utilizzato per analizzare l'esposizione superficie di qualsiasi proteina leptospiral a cui gli anticorpi specifici sono disponibili. Sia l'utilità e la limitazione del metodo dipende dal fatto che gli anticorpi utilizzati sono in grado di legarsi agli epitopi nativi. Dal momento che gli anticorpi sono spesso sollevate contro proteine ricombinanti, di epitopi nativi, superficie esposta proteine potrebbe non essere riconosciuto. Tuttavia, il metodo superficie IFA è uno strumento prezioso per lo studio delle componenti intatte superfici batterica. Questo metodo può essere applicato non solo per leptospire, ma anche spirochete e altri batteri gram-negativi. Per i più forti conclusioni sulla superficie-esposizione di OMP, un approccio globale che coinvolga diversi metodi di localizzazione delle cellule si consiglia 10.
Protocol
Discussion
La nostra tecnica IFA superficie è simile a quello utilizzato per dimostrare l'esposizione superficie di vari borrelial 15, 16 e leptospiral 12, 17 proteine. I dettagli del metodo superficie IFA qui descritti sono stati progettati per ridurre al minimo la manipolazione di cellule, nel tentativo di mantenere l'integrità della membrana esterna sfruttando la tendenza delle cellule Leptospira di aderire alle diapositive di vetro. Il metodo prevede una concentrazione più bassa (2% versus 4%) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Public Health Service concedere AI-34431 (a DAH) dell'Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive e da Fondi VA Medical Research (a DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
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