Imuno-fluorescência Ensaio de Leptospirose superfície exposta Proteínas
Summary
Um método eficiente para avaliar a exposição da superfície de proteínas leptospirose é descrito. O método é projetado especificamente para evitar a ruptura da membrana externa das células frágeis leptospirose. Esta técnica exige o emprego de vários controles negativos para avaliar a integridade da membrana externa e especificidade da reação de anticorpos.
Abstract
Proteínas de superfície bacteriana estão envolvidos em contato direto com células do hospedeiro e na absorção de nutrientes do meio ambiente 1. Por esta razão, a localização celular pode fornecer insights sobre o papel funcional de proteínas bacterianas. Localização de proteínas de superfície bacteriana é um passo fundamental para a identificação de fatores de virulência envolvidos nos mecanismos de patogenicidade.
Métodos para fracionamento 05/02 membranas leptospirose pode ser seletivo para uma certa classe de membrana externa proteínas (OMPs), como lipoproteínas contra OMPs transmembrana e, portanto, levar a erros de classificação. Isso provavelmente é devido a diferenças estruturais e como eles estão associados à membrana exterior. Lipoproteínas são associados com as membranas através de uma interação hidrofóbica entre a porção N-terminal de lipídios (três ácidos graxos) e os fosfolipídeos bicamada lipídica 6, 7. Em contraste, OMPs transmembrana são tipicamente integrados na bicamada lipídica por amphipathic β-folhas dispostas em uma estrutura barril do tipo 8, 9. Além disso, a presença de uma proteína na membrana externa, não garante necessariamente que a proteína ou seus domínios estão expostos na superfície. Espiroquetas membranas externas são conhecidos por serem métodos frágil e, portanto, exigir que envolvam a manipulação suave de células e inclusão de sub-superfície da proteína controles para avaliar a integridade da membrana externa.
Aqui, apresentamos um método de ensaio de imunofluorescência (IFA) para avaliar a exposição direta da superfície de proteínas em leptospiras intacta. Este método se baseia no reconhecimento de proteínas de superfície leptospirose pelo antígeno-anticorpos específicos. Nisto, os anticorpos específicos para OmpL54 10 são detetcted aftero ligação a nativa epitopos de superfície exposta. Comparação da reatividade de anticorpos para células intactas contra permeabilizadas permite a avaliação da distribuição celular e se ou não uma proteína é seletivamente presentes na superfície da leptospirose. A integridade da membrana externa devem ser avaliados utilizando anticorpos para uma ou mais proteínas de subsuperfície, preferencialmente localizado no periplasma.
A superfície método IFA pode ser usado para analisar a exposição da superfície de qualquer proteína leptospirose em que anticorpos específicos estão disponíveis. Tanto a utilidade e limitação do método depende se os anticorpos utilizados são capazes de se ligar a epítopos nativa. Desde que os anticorpos são freqüentemente levantadas contra proteínas recombinantes, epítopos de espécies nativas, de superfície exposta proteínas não pode ser reconhecido. No entanto, a superfície método IFA é uma ferramenta valiosa para estudar componentes de superfícies intactas bacteriana. Este método pode ser aplicado não só para leptospiras, mas também outras espiroquetas e bactérias gram-negativas. Para conclusões mais forte sobre as superfícies de exposição de OMPs, uma abordagem abrangente, envolvendo vários métodos de localização de células é recomendada 10.
Protocol
Discussion
Nossa superfície técnica de IFA é semelhante ao utilizado para demonstrar a exposição de superfície de vários borrelial 15, 16 e leptospirose 12, 17 proteínas. Os detalhes do método de superfície IFA aqui descritos são projetados para minimizar a manipulação de células em um esforço para manter a integridade da membrana externa, aproveitando a tendência de células Leptospira para aderir a lâminas de vidro. O método envolve uma menor concentração (2% versus 4%) de paraformaldeí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Serviço de Saúde Pública conceder AI-34431 (para DAH) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e Fundos VA Medical Research (para DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
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