一种有效的方法来评估钩端螺旋体蛋白质表面暴露描述。该方法是专门设计,以避免破坏脆弱的钩体细胞的外膜。这种技术需要雇用几个阴性对照,以评估外膜的完整性和特异性抗体反应。
细菌表面蛋白与宿主细胞的直接接触和吸收营养物质从环境1的参与。出于这个原因,细胞定位,可以提供细菌蛋白质的功能作用的见解。表面细菌蛋白质的本地化是对识别致病的机制,涉及的致病因素关键步骤。
分馏2-5钩端螺旋体膜的方法可为一定阶级的外膜蛋白(OMPS),如脂蛋白与跨膜外膜蛋白,有选择性的,因此导致的错误分类。这可能是由于结构上的差异,以及它们是如何相关的外膜。脂蛋白与膜通过脂基团之间的N -末端(3脂肪酸)和脂质双层磷脂6,7的疏水相互作用。相比之下,跨膜外膜蛋白通常集成在一个筒状结构,8,9排列的双亲性β-张成脂质双层。此外,在外膜蛋白的存在并不一定能保证,暴露在表面上的蛋白质或它的域。 Spirochetal外膜被称为脆弱,因此必要的方法,涉及温柔操纵子表面蛋白细胞和列入控制评估外膜的完整性。
在这里,我们目前的免疫荧光法(IFA)的方法来直接评估完好leptospires的蛋白质表面暴露。这种方法是基于对钩体表面蛋白抗原特异性抗体识别。在这里,特定抗体OmpL54 10 detetcted aftero约束力的本地人,表面抗原决定簇暴露。抗体反应的比较完整的与透细胞,使细胞分布进行评估,并与否的一种蛋白质是钩体表面选择性。应分摊的外膜的完整性,使用一个或多个地下蛋白质,最好在位于周质抗体。
表面IFA方法可用于分析任何钩端螺旋体特异性抗体的蛋白质表面暴露。的实用性和方法的限制,取决于是否能够绑定到本地的抗原表位的抗体。由于抗体往往提出对重组蛋白抗原表位,原生的,暴露于表面的蛋白质可能无法识别。然而,表面的IFA方法是一个完整的细菌表面成分研究的宝贵工具。这种方法不仅可应用于leptospires而且其他螺旋体和革兰氏阴性菌。更强的外膜蛋白的表面接触的结论,是一个全面的方法,涉及多种细胞定位方法推荐10。
我们的表面IFA技术是用来展示各种borrelial 15,16和钩端螺旋体12,17种蛋白质的表面接触的相似。这里描述的,旨在最大限度地减少操纵细胞在努力保持外膜的完整性,同时利用优势钩端螺旋体细胞的倾向,坚持以玻片表面IFA方法的细节。该方法涉及的多聚甲醛浓度较低(2%和4%),外层膜稳定缓冲液(PBS 5毫米氯化镁 2)和更少的洗涤步骤洗衣机比以前公布的协议12,…
The authors have nothing to disclose.
这项研究是支持公共卫生服务补助金的AI – 34431(DAH)由美国国立过敏和传染病研究所和VA医学研究基金(DAH)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |