Этот протокол описывает подготовку синтетический субстрат для тРНК<em> Entamoeba histolytica</em> ДНК / тРНК метилтрансферазы 2 (Dnmt2) Ehmeth гомолога и мера ее метилтрансферазы деятельности. Этот экспериментальный подход может быть использован для исследования деятельности других Dnmt2 белков.
Простейшие паразиты являются одними из самых разрушительных инфекционных агентов человека ответственным за различных заболеваний, включая амебиаз, который является одним из трех наиболее распространенных причин смерти от паразитарных заболеваний. Агент амебиаза является амеба Entamoeba histolytica паразит, который существует в рамках двух этапов: инфекционного кисты содержатся в пище или воде и инвазивных жизни трофозоит в кишечнике. Клинические проявления амебиаза диапазоне от бессимптомных до колит, дизентерия, или абсцессы печени. E. histolytica является одним из редких одноклеточного паразита с 5-метилцитозин (5mC) в своем геноме. 1, 2 содержит один ДНК-метилтрансферазы, Ehmeth, который принадлежит Dnmt2 семьи. 2 Dnmt2 роль в контроле за повторяющихся элементов имеет была создана в E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 и дрозофилы. 6 Наши последние исследования показали, что Ehmeth метилирует тРНК Asp, и эти данные показывают, что этот фермент имеет двойную ДНК / тРНК Asp метилтрансферазы деятельности. 7 Это наблюдение согласуется с двойной активностью , которые были сообщены для D. discoideum и D. MELANOGASTER 8. функциональное значение ДНК / специфичность тРНК Dnmt2 ферменты, пока неизвестно. Для решения этого вопроса, метод определения тРНК метилтрансферазы деятельности Dnmt2 белков была создана. В этом видео мы опишем простой подход для подготовки адекватного субстрата тРНК для Dnmt2 и метод измерения его тРНК метилтрансферазы деятельности.
В этой презентации мы показали, как подготовить активных компонентов для меры тРНК метилтрансферазы деятельность Е. histolytica Ehmeth фермента. Эта процедура может служить отправной точкой и быть легко адаптированы для других меру метилтрансферазы тРНК. Важно следовать процедурам, кото…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами от Израиля научного фонда и института семьи Раппапорт по исследованиям в области медицинских наук и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |