このプロトコルは、のための合成のtRNA基質の調製を記載し<em>赤痢アメーバ</em> DNA / tRNAのメチルトランスフェラーゼ2(Dnmt2)ホモログのEhmethとそのメチルトランスフェラーゼ活性の測定。この実験的なアプローチは、他のDnmt2タンパク質の活性を調べるために使用することができます。
原生動物の寄生虫は寄生虫症による死亡の最も一般的な3つの原因のひとつであるアメーバ症、を含む種々の疾患を担当し、人間の最も破壊的な感染性病原体の一つです。食物や水で検出された感染性嚢胞と腸における侵襲栄養体の生活:アメーバ症のエージェントは2つのステージの下に存在するアメーバ原虫赤痢アメーバです。無症候性であることから大腸炎、赤痢や肝膿瘍のアメーバ症の範囲の臨床症状。E.赤痢は、そのゲノムの5 -メチルシトシン(5mC)との珍しい単細胞寄生虫の一つです。1、2、それはDnmt2ファミリーに属する単一のDNAメチルトランスフェラーゼ、Ehmethが、含まれている。2 Dnmt2の役割繰返し要素の制御にありE.年に設立されて赤痢 、3 キイロタマホコリカビ 4,5とショウジョウバエは 6我々の最近の仕事は、そのEhmethメチル化のtRNA Aspを示している、そしてこの発見は、この酵素は二重のDNA / tRNAのAspをメチルトランスフェラーゼ活性を有することを示しています。7この観察は、二重の活動と一致しているD.について報告されていることカビとD.キイロ 8 Dnmt2酵素のDNA / tRNAの特異性の機能的意義は依然として不明である。この問題に対処するために、Dnmt2タンパク質のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性を決定する方法が確立されました。このビデオでは、我々はDnmt2ための十分なtRNAの基板を準備するために簡単なアプローチとそのtRNAのメチルトランスフェラーゼ活性を測定する方法を説明します。
本発表では、我々はE.のtRNAメチルトランスフェラーゼ活性の測定のためにアクティブコンポーネントを準備する方法を説明赤痢 Ehmeth酵素。この手順では、出発点として利用することもできますし、簡単に他のtRNAメチルトランスフェラーゼの測定に適応させる。酵素活性の最適な測定を保証するために、tRNAの基質のとtRNAメチルトランスフェラーゼ蛋白質の品質と整合性を維持す…
The authors have nothing to disclose.
本研究では、イスラエル科学財団と医科学の研究のためのラパポートファミリー研究所、およびドイツ学術振興協会(DFG)からの補助金によって支えられている。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |