يصف هذا البروتوكول في إعداد ركيزة الحمض الريبي النووي النقال الاصطناعية ل<em> المتحولة الحالة للنسج</em> الحمض النووي / الحمض الريبي النووي النقال methyltransferase 2 (Dnmt2) Ehmeth homolog وقياس نشاطها methyltransferase. ويمكن استخدام هذا المنهج التجريبي عن التحقيق في نشاط بروتينات Dnmt2 الأخرى.
الطفيليات هي من بين العوامل المعدية الأكثر تدميرا للبشر مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأمراض بما في ذلك داء الأميبات ، وهو أحد الأسباب الثلاثة الأكثر شيوعا للوفاة من أمراض الطفيلية. وكيل الأميبات هو طفيل الأميبا المتحولة الحالة للنسج موجود تحت مرحلتين : كيسة المعدية موجودة في الغذاء أو الماء ، ويعيشون أتروفة الغازية في الأمعاء. المظاهر السريرية للداء الأميبات مجموعة من كونها أعراض التهاب القولون إلى خراجات والدوسنتاريا أو الكبد. E. نسج هو واحد من الطفيليات وحيدة الخلية ونادرة مع methylcytosine – 5 (5mC) في الجينوم. 1 ، 2 وهو يحتوي على الحمض النووي واحد methyltransferase ، Ehmeth ، الذي ينتمي إلى عائلة Dnmt2 2 دور لDnmt2 في السيطرة على العناصر المتكررة و أنشئت في E. نسج ، 3 Dictyostelium discoideum 4،5 وذبابة الفاكهة. أظهرت 6 عملنا الأخيرة التي Ehmeth methylates الحمض الريبي النووي النقال ASP ، وهذه النتيجة تشير إلى أن هذا الانزيم لديها الحمض النووي المزدوج / الحمض الريبي النووي النقال الحية النشاط methyltransferase 7 وهذه الملاحظة هي في الاتفاق مع النشاط المزدوج أنه تم الإبلاغ عن د. discoideum ودال. melanogaster 8 الأهمية الفنية للخصوصية الحمض النووي / الحمض الريبي النووي النقال من Dnmt2 الانزيمات لا يزال مجهولا. لمعالجة هذه المسألة ، وقد تم تأسيسها وسيلة لتحديد النشاط من الحمض الريبي النووي النقال methyltransferase Dnmt2 البروتينات. في هذا الفيديو ، وصفنا نهج مباشرة لإعداد الركيزة الحمض الريبي النووي النقال كافية لDnmt2 وطريقة لقياس نشاطها methyltransferase الحمض الريبي النووي النقال.
في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية تحضير المكونات النشطة لقياس النشاط methyltransferase الحمض الريبي النووي النقال من E. نسج Ehmeth الانزيم. هذا الإجراء يمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق ويمكن تكييفها بسهولة لقياس methyltransferases الحمض الريبي النووي النقال الأخرى. من المهم أن تتبع الإ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل ومعهد عائلة رابابورت للبحوث في مجال العلوم الطبية ، وجمعية الألمانية للبحوث (DFG).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |