이 프로토콜은의 합성 tRNA 기판의 준비에 대해 설명합니다<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) 상동체의 Ehmeth과 methyltransferase 활동의 측정합니다. 이 실험 방법은 다른 Dnmt2 단백질의 활동을 조사하고 사용할 수 있습니다.
Protozoan의 기생충이 기생 질병에서 죽음의 세 가지 가장 일반적인 원인 중 하나입니다 amebiasis 포함한 질병의 다양한 책임을 인간의 가장 치명적인 전염성 에이전트 사이에 있습니다. amebiasis의 에이전트는 두 단계 아래에 존재하는 아메바 Entamoeba histolytica 기생충입니다 infective의 낭종은 소장에서 음식이나 물 침입 trophozoite 생활에서 발견했습니다. asymptomatic되는 대장염, 이질 또는 간 농양에 amebiasis 범위의 임상 발현. E. histolytica는 게놈의 5 methylcytosine (5mC)과 함께 진귀한 단세포 기생충 중 하나입니다. 1, 2, 그것은 Dnmt2 가족에 속하는 methyltransferase 단일 DNA, Ehmeth을 포함합니다. 2 반복 요소의 제어 Dnmt2에 대한 역할을했다 E. 년에 설립되었습니다 histolytica, 3 Dictyostelium의 discoideum 4,5와 Drosophila는 6. 우리의 최근 작업은 Ehmeth methylates tRNA ASP 나타났습니다,이 발견은이 효소가 이중 DNA / tRNA ASP methyltransferase 활동을했음을 나타냅니다. 7이 관찰 듀얼 활동 계약에 D.에 대한보고되었음을 discoideum와 D. melanogaster. Dnmt2 효소의 DNA / tRNA 특이성 8 기능적 중요성은 아직 알 수있다. 이 질문을 해결하기 위해, Dnmt2 단백질의 tRNA methyltransferase 활동을 결정하는 방법이 설립되었습니다. 이 비디오에서 우리는 Dnmt2위한 적절한 tRNA 기판을 준비하는 간단한 방법과 tRNA methyltransferase 활동을 측정하는 방법을 설명합니다.
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 E.의 tRNA methyltransferase 활동의 측정에 대한 활성 구성 요소를 준비하는 방법을 그림 histolytica Ehmeth 효소. 이 절차를 시작 지점으로 사용할 수 있으며, 쉽게 다른 tRNA의 methyltransferases의 측정에 대한 적응. 효소 활동의 최적의 조치를 확보하기 위해 tRNA 기판과 tRNA methyltransferase 단백질의 품질과 무결성을 보존 절차를 수행하는 것이 중요합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 이스라엘 과학 재단과 의료 과학 연구를위한 Rappaport 가족 연구소 및 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |