Ce protocole décrit la préparation d'un substrat synthétique pour l'ARNt<em> Entamoeba histolytica</em> ADN / ARNt méthyltransférase 2 (Dnmt2) Ehmeth homologue et la mesure de son activité méthyltransférase. Cette approche expérimentale peut être utilisée pour étudier l'activité d'autres protéines Dnmt2.
Les parasites protozoaires sont parmi les agents infectieuses les plus dévastatrices de l'homme responsable d'une variété de maladies, notamment l'amibiase, qui est l'une des trois causes les plus fréquentes de décès par maladie parasitaire. L'agent de l'amibiase est l'amibe parasite Entamoeba histolytica qui existe sous deux étapes: le kyste infectieux présents dans les aliments ou l'eau et les vivants trophozoïte envahissantes dans l'intestin. Les manifestations cliniques de l'amibiase large d'être asymptomatique à la colite abcès, la dysenterie ou le foie. E. histolytica est l'un des rares du parasite unicellulaire, avec le 5-méthylcytosine (5mC) dans son génome. 1, 2 Il contient un ADN simple méthyltransférase, Ehmeth, qui appartient à la famille Dnmt2. 2 Un rôle pour Dnmt2 dans le contrôle des éléments répétitifs a été établi dans E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 et la drosophile. 6 Nos travaux récents ont montré que Ehmeth méthylates ARNt Asp, et cette constatation indique que cette enzyme a un ADN double / ARNt Asp activité méthyltransférase. 7 Cette observation est en accord avec la double activité qui a été rapporté pour D. discoideum et D. melanogaster. 8 La signification fonctionnelle de la spécificité ADN / ARNt de Dnmt2 enzymes est encore inconnue. Pour répondre à cette question, une méthode pour déterminer l'ARNt activité méthyltransférase d'Dnmt2 protéines a été établie. Dans cette vidéo, nous décrivons une approche simple pour préparer un substrat adéquat pour Dnmt2 ARNt et une méthode pour mesurer son activité ARNt méthyltransférase.
Dans cette présentation, nous avons illustré la façon de préparer des composants actifs pour la mesure de l'ARNt activité méthyltransférase de E. histolytica Ehmeth enzyme. Cette procédure peut servir comme point de départ et d'être facilement adapté à la mesure de l'ARNt méthyltransférases d'autres. Il est important de suivre les procédures qui permettent de préserver la qualité et l'intégrité du substrat ARNt et de l'ARNt méthyltransférase protéines pour assurer u…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation d'Israël et de l'Institut des sciences familiales Rappaport pour la recherche en sciences médicales, et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |