פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי עבור<em> Entamoeba histolytica</em> הדנ"א / tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) Ehmeth homolog ואת מידת הפעילות methyltransferase שלה. גישה זו הניסוי יכול לשמש חוקרת את פעילותו של Dnmt2 חלבונים אחרים.
טפילים protozoan הם בין גורמים מדבקים הרסנית ביותר של בני אדם אחראי מגוון רחב של מחלות כולל amebiasis, שהוא אחד משלושת הגורמים השכיחים ביותר למוות ממחלות טפיליות. הסוכן של amebiasis הוא טפיל האמבה Entamoeba histolytica שקיים תחת שני שלבים: ציסטה זיהומיות למצוא מזון או מים חיים trophozoite פולשנית במעי. הביטויים הקליניים של מגוון amebiasis מלהיות אסימפטומטיים עד מורסות, קוליטיס דיזנטריה או כבד. E. histolytica הוא אחד הטפיל unicellular נדיר עם 5-methylcytosine (5mC) בגנום שלו. 1, 2 הוא מכיל דנ"א יחיד methyltransferase, Ehmeth, אשר שייך למשפחת Dnmt2. 2 Dnmt2 תפקיד בשליטה על אלמנטים חוזרים יש הוקמו E. histolytica, 3 discoideum Dictyostelium 4,5 ו תסיסנית. 6 העבודה האחרונה שלנו הוכיח כי Ehmeth methylates tRNA ASP, ממצא זה מראה כי אנזים זה יש DNA כפול / tRNA פעילות methyltransferase-ASP. 7 תצפית זו עולה בקנה אחד עם פעילות כפולה כך דווחה עבור ד discoideum וד melanogaster. 8 משמעות תפקודית של סגוליות DNA / tRNA של Dnmt2 אנזימים עדיין לא ידוע. כדי לענות על שאלה זו, שיטה כדי לקבוע את פעילות tRNA methyltransferase של Dnmt2 חלבונים הוקמה. בסרטון הזה, אנו מתארים גישה פשוטה להכין מצע tRNA מתאים Dnmt2 ו שיטה למדידת פעילות tRNA methyltransferase שלה.
במצגת זו, הדגמנו איך להכין את הרכיבים הפעילים במשך למדוד את הפעילות של ה tRNA methyltransferase histolytica אנזים Ehmeth. הליך זה יכול לשמש כנקודת פתיחה ו להתאים בקלות מידה של methyltransferases tRNA אחרים. חשוב לבצע את ההליכים לשמר את איכות על שלמות המצע tRNA של החלבון tRNA methyltransferase כדי להבט…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע ומכון רפפורט למחקר במדעי הרפואה, ואת Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |