Протокол описывающих применение системы проточной ячейки для выращивания и анализа микробной биопленки для конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM).
Многие микробных клеток есть способность образовывать сидячие микробных сообществ определяется как биопленки, что изменились физиологические и патологические свойства по сравнению с свободной микроорганизмов, обитающих. Биопленки в природе часто трудно провести расследование и проживают в плохо определенных условиях 1. Использование прозрачной субстрата можно устройстве системы, в которой простые биопленки могут быть изучены в неразрушающим способом в режиме реального времени: здесь мы демонстрируем сборки и эксплуатации модели системы проточной кюветы для лабораторного исследования 3D микробных биопленок генерации высокую воспроизводимость при определенных условиях 2,3.
Система состоит из проточной ячейки, которая служит рост камера для биопленки. Проточная ячейка снабжена питательных веществ и кислорода из среды колбу с помощью перистальтического насоса и провел среду собирается в контейнер для отходов. Такое построение системы позволяет потока непрерывного поступления питательных веществ и управления, например, антибиотиков с минимальным нарушением клеток, выращенных в проточную камеру. Более того, условия потока в проточной ячейке позволяет исследования биопленки воздействию напряжения сдвига. Пузыря захвата устройства пузырьки воздуха от границ трубки, которые иначе могут нарушить структуру биопленки в потоке клеток.
Система проточной ячейки совместим с конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM) и может таким образом обеспечить высоко детализированные 3D сведения о разработке микробных биопленок. Ячейки в биопленки могут быть помечены флуоресцентных зондов или белки совместимы с CLSM анализа. Это позволяет в оперативном режиме визуализацию и позволяет исследовать ниши в развивающихся биопленки. Микробная взаимосвязь, изучение антимикробных агентов или выражения специфических генов, имеют много экспериментальных установок, которые могут быть исследованы в системе клетка потока.
Мы показали, система проточной ячейки, которая представляет собой мощный инструмент в биопленки исследований. В сочетании с 3D-визуализации с помощью конфокальной микроскопии, система имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами анализа микробной биопленки с помощью более традиционных микроскопических методов. Эта система позволяет 3D визуализация жизни микробных сообществ биопленки без нарушения сообщества. Световая микроскопия не будет предоставлять подробную информацию о нишах биопленки и в то время как электронная микроскопия обеспечивает нано разрешением биопленки, он не позволяет жить изображений клеток.
Использование описанной системе течения в канале мы уже выяснены пространственного распределения бактериальной клетки, чувствительные к нескольким антибиотикам 5-8 (рис. 4а), распределение внеклеточных соединений, например, ДНК 9-11 и распределение подвижных и неподвижных клетки же вида в течение бактериального сообщества 4,6,9 (рис. 4в). Мы предполагаем, что поток в системе клетка может быть использован для изучения аспектов дрожжей биопленки. Это может быть пространственно временного распределения дрожжей биопленки в ответ на экологические факторы, такие как фунгициды, а также идентификация генов, вовлеченных в развитие дрожжей биопленки. Хотя дрожжи не известно дифференцироваться в подвижные и неподвижные клетки, другие аспекты диверсификации биопленки могут быть исследования, такие как морфологический переход от дрожжей до pseudohyphal клетки и переход от гаплоидных для диплоидных клеток.
Мы показали, что система соответствует несколько видов микроорганизмов и будет работать с несколькими методами окрашивания. Различных зондов окрашивания и флуоресцентные белки, такие как GFP, включите конкретных расследований нишу в развивающемся биопленки и является эффективным инструментом для анализа влияния антимикробных препаратов или других факторов окружающей среды. Информации, которая может быть получена очень подробно (рис. 4) и возможности в биопленки могут быть количественно с компьютерными программами, такими как КОМСТАТ 12,13.
В целом, наиболее важным аспектом протокола является то, что это трудоемкий процесс. Кроме того, ограничения, что клетки должны быть способны расти на не-люминесцентные, прозрачной поверхности. . С биопленки образуются анализируется с помощью конфокальной микроскопии, глубина, которые могут быть исследованы ограничен до нескольких сотен микрометров 14 Есть и другие технические ограничения, присущие дизайн: система не подходит для высокопроизводительного скрининга, как опытный исследователь может работать не более чем около 15 каналов на каждый эксперимент, который, в свою очередь, может занять несколько дней, чтобы подготовиться. Тем не менее, антибиотики или мутанты, которые считаются актуальными для биопленки исследования могут быть изначально массу экранированный с другими методами, такими, как кристалл фиолетового окрашивания до наиболее интересных кандидатов передаются системой проточной кюветы. Титульные листы стекла очень тонкие и легко ломаются, и следует проявлять осторожность при работе с системами. Кроме того трубки должны быть рассмотрены в день во время запуска эксперимента, как значительный "назад-рост" во впускной трубы чуть выше по течению потока клетки может произойти. Такое загрязнение может быть решена путем удаления нескольких сантиметров силиконовые трубки от входа стороне потока клеток, с использованием стерильной техники.
Рисунок 4) 4 день старого PAO1 -. GFP биопленки рассматриваются в течение 24 часов с Колистин и пропидий йодида для мертвых окрашивания (красное пятно) б) 3D презентация три дня старый P. PAO1 палочки (P. палочки дикого типа) – GFP биопленки 6, в) 3D изображение презентация PAO1 – CFP Пила мутант (синий) с PAO1 дикого типа YFP (желтый) г) 5 дневных PAO1 – GFP биопленки представлены как 3D картина электронной) 26 ч С. CEREVISIAE (PTR3 мутанта в CEN.PK фоне) биопленки окрашивали Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |