协议描述流通池系统中的应用激光共聚焦显微镜(CLSM)为不断发展和分析微生物生物膜。
许多微生物细胞的能力,形成社区定义为改变相比,免费的活体微生物的生理和病理性质生物膜固着微生物。生物膜的性质往往难以进行调查,居住在定义不清的条件1。采用了透明的底层,它是可能的设备,一个简单的生物膜可以在一个非破坏性的方式检查实时系统:在这里我们展示了一个流动的细胞模型系统的装配和操作,在体外三维微生物生物膜研究根据定义良好的条件2,3高重现性。
该系统由一个流单元,可作为生物膜的生长室。通过蠕动泵和流通池提供的营养物质和氧气从中期瓶中花中型物的容器收集。这种流系统的建设使干扰最小流室中生长的细胞的营养物质,如抗生素管理的持续供应。此外,流细胞内的流动条件允许的情况下暴露于剪应力的生物膜研究。泡沫捕集设备的局限,从管,否则可能会破坏在流动细胞的生物膜结构的气泡。
流通池系统,激光共聚焦显微镜(CLSM)兼容,从而可以提供非常详细的有关开发微生物生物膜的三维信息。细胞的生物膜可以兼容CLSM分析与荧光探针或蛋白质的标记。这使得网上可视化,并允许在发展中生物膜的壁龛的调查。微生物的相互关系,调查抗菌剂或特定基因的表达,流电池系统,可在调查的许多实验设置。
我们已经证明了一个流动池的系统,在生物膜调查强大的工具。结合三维成像共聚焦显微镜,该系统已在其他更传统的显微技术分析微生物生物膜方法相比的优势范围。这个系统允许没有扰乱社会生活中的微生物生物膜社区的三维可视化。光镜将不提供有关生物膜龛的详细信息,而电子显微镜提供纳米级分辨率的生物膜,它不会允许活细胞成像。
使用我们先前已经阐明5-8(图4a)几种抗生素敏感,细菌细胞外化合物分布的空间分布的描述的流道系统, 如DNA 9-11和的活动和非活动细胞的分布同一物种内的细菌群落4,6,9(图4c)。我们设想,流通池系统可以被用来研究酵母生物膜方面。这可能是环境因素,如杀菌剂以及识别有关的基因在酵母中生物膜的发展酵母生物膜的时空时空分布。虽然酵母是不知道的活动和非活动的细胞分化成其他生物膜的多样化方面,可从酵母到假菌丝细胞形态的转变和从单倍体二倍体细胞的转移,如研究。
我们已经表明系统符合一些微生物物种,并会与几个染色技术。各种不同的染色探针和荧光蛋白如GFP,使在发展中生物膜的具体利基调查和分析抗菌药物或其他环境因素的影响是一个有效的工具。可以得到的信息是非常详细(图4),在生物膜的功能,可以与计算机程序,如COMSTAT 12,13量化。
总体来说,协议的最关键的环节是事实,即它是一个耗时的过程。这也是一个限制,即细胞能够生长在一个无荧光,透明的表面。由于生物膜的形成是使用共聚焦显微镜,是有限的,以几百微米14的深度,可以调查分析,有进一步的技术在设计中所固有的局限性:高通量筛选系统是不适合作为一个经验丰富的研究员,可以处理在大多数实验中,大约15%的渠道,这反过来可能需要数天准备。然而,抗生素或生物膜的研究被认为有关的突变体,最初可以与其他方法,如结晶紫染色筛选最有趣的候选人之前转移到流通池系统的质量。盖玻璃板非常薄,容易折断,处理系统时,应小心。此外,应检查油管每天一个实验运行期间,可能会出现相当大的“回到增长”只是上游的流量细胞的入口管。从几厘米的硅胶管,进气侧流细胞通过消除这种污染是可以解决的,用无菌技术。
图4 A)4日龄PAO1 -绿色荧光蛋白生物膜粘菌素和碘化丙啶治疗24小时死染色(红染色)B)为期三天的3D演示老体育假单胞菌 PAO1( 铜绿假单胞菌野生型) -绿色荧光蛋白生物膜6 C)3D一个PAO1图片演示- CFP皮拉突变(蓝色)一个PAO1野生型YFP(黄色)D)5天的老PAO1 -绿色荧光蛋白生物膜作为3D图片发送)26 H S。沾满酵母 (PTR3 CEN.PK背景突变)生物膜与祥发,9月15日 。
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |