بروتوكول يصف تطبيق نظام تدفق لزراعة الخلايا والأغشية الحيوية الميكروبية تحليل ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM).
العديد من الخلايا الجرثومية لديهم القدرة على تكوين المجتمعات الميكروبية لاطئة على النحو المحدد الأغشية الحيوية التي غيرت الخصائص الفيزيولوجية المرضية ومقارنة الكائنات الحية المجهرية الحرة. الأغشية الحيوية في الطبيعة وغالبا ما يصعب التحقيق فيها ويقيمون في ظل ظروف سيئة تعريف 1. باستخدام التحتية شفافة فمن الممكن أن الجهاز نظام حيث يمكن فحص بسيط الأغشية الحيوية بطريقة غير المدمرة في الوقت الحقيقي : نحن هنا لشرح تجميع وتشغيل نموذج نظام تدفق الخلية ، لفي الدراسات 3D المختبر من الأغشية الحيوية الميكروبية توليد استنساخ عالية في ظل ظروف محددة جيدا 2،3.
ويتكون النظام من خلية تدفق التي هي بمثابة حجرة النمو للبيوفيلم. ويتم تزويد الخلية مع تدفق المواد الغذائية والأكسجين من قارورة المتوسطة عن طريق مضخة تمعجية والمتوسطة التي يتم جمعها في وعاء قضى النفايات. هذا البناء للنظام يسمح تدفق إمدادات مستمرة من المواد الغذائية والإدارة من المضادات الحيوية مثل اضطراب مع الحد الأدنى من الخلايا المزروعة في غرفة التدفق. وعلاوة على ذلك ، فإن ظروف تدفق داخل الخلية تدفق تسمح دراسات بيوفيلم تتعرض لإجهاد القص. فقاعة محاصرة فقاعات الهواء حدود الجهاز من الأنابيب التي على خلاف ذلك قد يعطل هيكل بيوفيلم في الخلية التدفق.
نظام تدفق الخلية متوافق مع ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM) ، ويمكن بالتالي توفير المعلومات 3D مفصلة للغاية حول تطوير الأغشية الحيوية الميكروبية. ويمكن تسمية الخلايا في بيوفيلم مع تحقيقات أو البروتينات الفلورية متوافق مع تحليل CLSM. هذا التصور يمكن على الانترنت ويسمح التحقيق في محاريب في بيوفيلم النامية. الترابط الميكروبية ، والتحقيق في العوامل المضادة للجراثيم أو التعبير عن جينات محددة ، هي من الاجهزة التجريبية العديدة التي يمكن أن يتم التحقيق في تدفق نظام الخلية.
لقد أثبتنا نظام تدفق الخلية ، التي تمثل أداة قوية في التحقيقات بيوفيلم. جنبا إلى جنب مع التصوير 3D بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، ونظام لديها مجموعة من المزايا بالمقارنة مع غيرها من أساليب تحليل الأغشية الحيوية الميكروبية عن طريق التقنيات المجهرية أكثر تقليدية. هذا النظام يسمح التصور 3D معيشة المجتمعات بيوفيلم الجرثومية دون اضطراب في المجتمع. وسوف المجهر الضوئي لم تقدم معلومات مفصلة حول منافذ للبيوفيلم وبينما يوفر القرار المجهر الإلكتروني النانو من بيوفيلم ، فإنه لا يسمح يعيش التصوير الخلية.
استخدام قناة تدفق وصف النظام لدينا سابقا توضيح التوزيع المكاني للالخلايا البكتيرية للمضادات الحيوية الحساسة عدة 5-8 (الشكل 4A) ، وتوزيع المركبات خارج الخلية ، مثل الحمض النووي 11/09 ، وتوزيع خلايا متحركة وغير متحركة ، من نفس النوع داخل المجتمع البكتيرية 4،6،9 (الشكل 4C). ونحن نتصور أنه يمكن استخدام نظام تدفق خلية لدراسة جوانب من الأغشية الحيوية الخميرة. قد يكون هذا التوزيع المكانية الزمانية للبيوفيلم الخميرة استجابة لعوامل بيئية مثل الفطريات ، وكذلك التعرف على الجينات المسؤولة عن التنمية بيوفيلم الخميرة. رغم أنها ليست معروفة الخميرة على التمايز إلى خلايا متحركة وغير متحركة ، قد جوانب أخرى من تنويع بيوفيلم أن مثل هذه الدراسات حيث أن التحول المورفولوجي لخلايا الخميرة من الكاذبة ، والتحول إلى خلايا من فرداني ضعفاني.
لقد أظهرنا النظام الذي يتوافق مع العديد من الأنواع الميكروبية ، وسوف تعمل مع عدة تقنيات التلوين. مجموعة متنوعة من تلطيخ تحقيقات مختلفة والبروتينات الفلورية ، مثل GFP ، تمكين التحقيقات مكانة معينة في بيوفيلم النامية وأداة فعالة في تحليل تأثير العوامل المضادة للميكروبات أو عوامل بيئية أخرى. المعلومات التي يمكن الحصول عليها هو مفصل جدا (الشكل 4) ، ويمكن أن يكون كميا الميزات في بيوفيلم مع برامج الكمبيوتر مثل COMSTAT 12،13.
عموما ، فإن الجانب الأكثر أهمية من البروتوكول هو حقيقة أنها هي عملية تستغرق وقتا طويلا. بل هو أيضا وجود قيود على الخلايا التي تحتاج إلى أن تكون قادرة على النمو على سطح غير الفلورسنت شفافة. . منذ يتم تحليل بيوفيلم تشكيلها باستخدام المجهر متحد البؤر ، وعمق التحقيق التي يمكن أن يقتصر على بضع مئات ميكرومتر 14 هناك مزيد من القيود التقنية المتأصلة في التصميم : ليست مناسبة لنظام الفرز إنتاجية عالية ، وخبرة الباحث يمكن التعامل في معظم القنوات نحو 15 في التجربة ، والتي بدورها يمكن أن تستغرق عدة أيام للاستعداد. ومع ذلك ، يمكن للمضادات الحيوية أو المسوخ التي تعتبر ذات صلة للدراسات بيوفيلم في البداية فحص شامل لأساليب أخرى مثل تلطيخ البنفسجي الكريستال قبل أن يتم نقل المرشحين الأكثر إثارة للاهتمام لتدفق نظام الخلية. الأوراق والزجاج غطاء هي رقيقة جدا وكسر بسهولة ، وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع النظم. وينبغي أن تدرس بالإضافة الأنبوب اليومية خلال تشغيل للتجربة ، لأن قدرا كبيرا من "العودة الى تحقيق النمو" في أنابيب مدخل المنبع فقط من الخلايا يمكن أن يحدث تدفق. يمكن حلها عن طريق إزالة هذا التلوث عدة سنتيمترات من أنبوب السيليكون من الجانب مدخل تدفق الخلايا ، وذلك باستخدام تقنية معقمة.
الرقم 4 (أ) PAO1) 4 ايام العمر — GFP بيوفيلم للتعامل مع 24H كوليستين ويوديد Propidium لتلطيخ القتلى (الأحمر وصمة عار) ب) العرض 3D لمدة ثلاثة أيام P. القديمة PAO1 الزنجارية (P. الزنجارية نوع البرية) — GFP بيوفيلم 6 ج) 3D عرض صورة لPAO1 — بيلا CFP متحولة (الأزرق) مع YFP PAO1 نوع البرية (الصفراء) د) 5 ايام PAO1 القديمة — GFP بيوفيلم قدمت بوصفها 3D ه صورة) 26 ح س. البيرة (PTR3 متحولة في الخلفية CEN.PK) بيوفيلم ملطخة Syto – 9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |