Protocol beschrijft de toepassing van een flow cel-systeem voor de teelt en het analyseren van microbiële biofilms voor Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM).
Veel microbiële cellen hebben het vermogen om ongesteeld microbiële gemeenschappen gedefinieerd als biofilms die fysiologische en pathologische eigenschappen te hebben veranderd in vergelijking met vrij levende micro-organismen te vormen. Biofilms in de natuur zijn vaak moeilijk te onderzoeken en te verblijven onder slecht gedefinieerde condities: 1. Met behulp van een transparant substraat is het mogelijk om het apparaat een systeem waar simpel biofilms kunnen in een niet-destructieve manier worden onderzocht in real-time: hier tonen we aan de montage en de werking van een flow cel modelsysteem, voor in vitro 3D-studies van microbiële biofilms het genereren van hoge reproduceerbaarheid onder goed gedefinieerde condities 2,3.
Het systeem bestaat uit een flow cel die dient als kamer voor de groei van biofilm. De stroom cel is voorzien van voedingsstoffen en zuurstof uit een medium fles via een peristaltische pomp en bracht medium wordt verzameld in een afvalcontainer. Deze constructie van de stroming systeem maakt een continue aanvoer van voedingsstoffen en de administratie van bijvoorbeeld antibiotica met een minimale verstoring van de cellen gekweekt in de stroom kamer. Bovendien is de stroom omstandigheden binnen de stroom cel laten studies van biofilm blootgesteld aan shear stress. Een bel trapping apparaat grenzen luchtbellen uit de slang, die anders kunnen de biofilm-structuur in de stroom cel verstoren.
De stroom cel systeem is compatibel met Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) en kan daardoor bieden een zeer gedetailleerde 3D-informatie over het ontwikkelen van microbiële biofilms. Cellen in de biofilm kan worden gelabeld met een fluorescerende probes of eiwitten compatibel is met CLSM analyse. Dit maakt online visualisatie en maakt het mogelijk onderzoek naar niches in de ontwikkelingslanden biofilm. Microbiële samenhang, het onderzoek van antimicrobiële middelen of de expressie van specifieke genen, zijn van de vele experimentele opstellingen die kunnen worden onderzocht in de stroom cel systeem.
We hebben aangetoond dat een flow cel systeem dat een krachtig instrument in de biofilm onderzoeken vertegenwoordigt. In combinatie met 3D-beeldvorming door confocale microscopie, het systeem heeft een bereik van voordelen ten opzichte van andere methoden voor het analyseren van microbiële biofilms door middel van meer traditionele microscopische technieken. Dit systeem maakt 3D-visualisatie van het leven microbiële biofilm gemeenschappen zonder verstoring van de gemeenschap. Lichtmicroscopie zal geen gedetailleerde informatie over de niches van de biofilm en terwijl elektronenmicroscopie biedt nanoschaal resolutie van de biofilm, het niet mogelijk live cell imaging.
Met behulp van de beschreven stromingskanaal systeem dat we eerder hebben toegelicht de ruimtelijke verdeling van de bacteriële cellen die gevoelig zijn voor meerdere antibiotica 5-8 (figuur 4a), de distributie van extracellulaire verbindingen, bijvoorbeeld DNA 9-11 en, de verdeling van beweeglijke en niet-beweeglijke cellen dezelfde soort binnen een bacteriële gemeenschap 4,6,9 (Figuur 4c). Wij voorzien dat de stroom cel systeem kan worden gebruikt om aspecten van gist biofilms te bestuderen. Dit kan de spatio temporele verdeling van gist biofilm in reactie op omgevingsfactoren zoals fungiciden, met een overzicht van de genen die betrokken zijn in gist biofilm ontwikkeling. Hoewel gist is niet bekend dat het differentiëren in beweeglijke en niet-beweeglijke cellen, kunnen andere aspecten van de biofilm diversificatie zijn studies, zoals de morfologische verschuiving van gist tot pseudohyfale cellen en de verschuiving van haploïde tot diploïde cellen.
We hebben laten zien een systeem dat voldoet aan een aantal microbiële species en zal werken met diverse kleuringen technieken. Een verscheidenheid van verschillende kleuren probes en fluorescerende eiwitten, zoals GFP, in staat stellen specifieke niche onderzoek in de ontwikkelingslanden biofilm en is een efficiënt hulpmiddel bij het analyseren van het effect van antimicrobiële middelen of andere omgevingsfactoren. De informatie die verkregen kan worden is zeer gedetailleerd (figuur 4) en functies in de biofilm kunnen worden gekwantificeerd met computerprogramma's zoals COMSTAT 12,13.
Over het geheel genomen het meest kritische aspect van het protocol is het feit dat het een tijdrovend proces. Het is ook een beperking die de cellen nodig hebben om te kunnen groeien op een niet-fluorescerende, transparante oppervlak. . Sindsdien de biofilm is geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop, de diepte die kan worden onderzocht is beperkt tot een paar honderd micrometer 14 Er zijn nog meer technische beperkingen die inherent zijn aan het ontwerp: het systeem is niet geschikt voor high throughput screening, als een ervaren onderzoeker kan omgaan met ten hoogste ongeveer 15 kanalen per experiment, die op zijn beurt kan enkele dagen voor te bereiden. Echter, antibiotica of mutanten die worden beschouwd als relevant voor biofilm studies in eerste instantie massa gescreend met andere methoden, zoals crystal violet vlekken voor de meest interessante kandidaten worden overgebracht naar de stroom cel systeem. De cover glasplaten zijn erg dun en breken gemakkelijk, en de zorg moeten worden genomen bij het hanteren van de systemen. Naast de slang moet dagelijks worden onderzocht tijdens de run van een experiment, als een aanzienlijke "back-groei 'in de inlaat buizen net stroomopwaarts van de stroming cellen kunnen optreden. Deze besmetting kan worden opgelost door het verwijderen van enkele centimeters van siliconen buis van de inlaatzijde van de stroom cellen, met behulp van steriele techniek.
Figuur 4 a) 4 dagen oud PAO1 -. GFP biofilm behandeld voor 24 uur met Colistine en propidiumjodide voor dode vlekken (rode vlek), b), 3D-presentatie van een drie dagen oud P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa wild type) – GFP biofilm 6 c), 3D-foto presentatie van een PAO1 – GVB pila mutant (blauw) met een PAO1 wild type YFP (geel) d) 5 dagen oud PAO1 – GFP biofilm gepresenteerd als een 3D- foto e) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutant in CEN.PK achtergrond) biofilm gekleurd met SYTO-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |