Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).
Viele mikrobielle Zellen haben die Fähigkeit, sessile mikrobielle Gemeinschaften wie Biofilmen, die physiologischen und pathologischen Eigenschaften verändert haben im Vergleich zu frei lebenden Mikroorganismen definierte Form. Biofilme in der Natur sind oft schwer zu untersuchen und unter schlecht definierten Bedingungen 1 befinden. Mit einem transparenten Substrat ist es möglich, Gerät ein System, wo einfache Biofilmen in eine nicht-destruktive Weise in Echtzeit untersucht werden kann: hier zeigen wir die Montage und den Betrieb einer Durchflusszelle Modellsystem für in vitro 3D-Untersuchungen der mikrobiellen Biofilmen Erzeugung hoher Reproduzierbarkeit unter genau definierten Bedingungen 2,3.
Das System besteht aus einer Flow-Zelle, die als Klimakammer für die Biofilm dient. Die Messzelle ist mit Nährstoffen und Sauerstoff aus einem Medium Kolben über eine peristaltische Pumpe zugeführt und verbrauchte Medium wird in einem Abfallbehälter gesammelt. Dieser Aufbau des Flow-System ermöglicht eine kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen und Verwaltung von zB Antibiotika mit minimaler Störung der Zellen in der Strömungskammer gewachsen. Darüber hinaus ermöglichen die Strömungsverhältnisse innerhalb der Durchflusszelle Studien von Biofilm ausgesetzt Schubspannung. Eine Blase Auffangeinrichtung Grenzen Luftblasen aus dem Schlauch, die sonst der Biofilm-Struktur in der Durchflusszelle stören könnten.
Die Durchflusszelle System ist kompatibel mit konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und kann dadurch eine sehr detaillierte 3D-Informationen zur Entwicklung von mikrobiellen Biofilmen. Cells im Biofilm kann mit fluoreszierenden Sonden oder Proteine mit CLSM-Analyse bezeichnet werden. Dies ermöglicht Online-Visualisierung und ermöglicht Untersuchungen von Nischen in den Entwicklungsländern Biofilm. Mikrobielle Zusammenhang, Untersuchung von antimikrobiellen Wirkstoffen oder die Expression bestimmter Gene, sind die vielen Versuchsaufbauten, die in der Durchflusszelle System untersucht werden kann.
Wir haben eine Durchflusszelle System, das ein mächtiges Werkzeug in Biofilm Untersuchungen stellt unter Beweis gestellt. In Kombination mit 3D-Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, hat das System eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden der Analyse von mikrobiellen Biofilmen mit Hilfe von traditionellen mikroskopischen Techniken. Dieses System ermöglicht 3D-Visualisierung von lebenden mikrobiellen Biofilm Gemeinden ohne Störung der Gemeinschaft. Die Lichtmikroskopie wird keine detaillierten Informationen über Nischen des Biofilms und während der Elektronenmikroskopie bietet nanoskaliger Auflösung des Biofilms, es nicht zulassen, Live Cell Imaging.
Mit dem beschriebenen Strömungskanal System, das wir zuvor die räumliche Verteilung der Bakterienzellen empfindlich auf verschiedene Antibiotika 5-8 (Abbildung 4a), die Verteilung der extrazellulären Verbindungen aufgeklärt, wie zB DNA 9-11 und die Verteilung der beweglichen und unbeweglichen Zellen der gleichen Art innerhalb einer bakteriellen Gemeinschaft 4,6,9 (Abbildung 4c). Wir sehen, dass die Messzelle System verwendet werden, um Aspekte der Hefe Biofilme zu untersuchen. Dies kann die räumlich zeitliche Verteilung der Hefe Biofilm als Reaktion auf Umweltfaktoren wie Fungizide sowie die Identifizierung von Genen in Hefe Biofilm Entwicklung einbezogen werden. Obwohl Hefe nicht bekannt ist, in bewegliche und unbewegliche Zellen differenzieren können auch andere Aspekte des Biofilms Diversifizierung Studien wie die morphologische Übergang von der Hefe bis zum pseudohyphal Zellen und die Verlagerung von haploid zu diploiden Zellen werden.
Wir haben ein System, das mit mehreren mikrobielle Spezies entsprechen und wird mit mehreren Färbetechniken Arbeit gezeigt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Färbung Sonden und fluoreszierende Proteine, wie GFP, ermöglichen es, bestimmte Nische Untersuchungen in den Entwicklungsländern Biofilm und ist ein effizientes Werkzeug für die Analyse der Wirkung von Antibiotika oder anderen Umweltfaktoren. Die Informationen, die gesammelt werden können, ist sehr detailliert (Abbildung 4) und verfügt in den Biofilm kann mit Computerprogrammen wie COMSTAT 12,13 quantifiziert werden.
Insgesamt ist der wichtigste Aspekt des Protokolls der Tatsache, dass es ein zeitaufwändiger Prozess ist. Es ist auch eine Einschränkung, dass die Zellen müssen in der Lage, auf einem nicht-fluoreszierenden, transparenten Oberfläche wachsen. . Da der Biofilm gebildet wird analysiert mit einem konfokalen Mikroskop, die Tiefe, dass untersucht wird, um ein paar hundert Mikrometer 14 begrenzt werden kann, gibt es weitere technische Beschränkungen, die in das Design: Das System ist nicht für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, da ein erfahrener Forscher können höchstens 15 Kanäle pro Experiment, das wiederum mehrere Tage dauern kann zur Vorbereitung zu behandeln. Allerdings können Antibiotika oder Mutanten, die als relevant für die Biofilm-Studien werden zunächst Masse mit anderen Methoden wie Kristallviolettfärbung abgeschirmt vor den interessantesten Kandidaten für die Flusszelle System übertragen werden. Der Deckel Glasscheiben sind sehr dünn und brechen leicht, und darauf zu achten, bei der Handhabung der Systeme. Neben den Schlauch sollte täglich während der Laufzeit eines Experiments untersucht werden, als erhebliche "back-Wachstum" in den Einlaßrohre kurz vor der Strömung Zellen auftreten können. Solche Verunreinigungen können durch das Entfernen von mehreren Zentimetern von Silikon-Schlauch von der Eingangsseite der Strömung Zellen gelöst werden, indem sterile Technik.
Abbildung 4 a) 4 Tage alte PAO1 -. GFP Biofilm für 24 Stunden mit Colistin und Propidiumiodid behandelt tot-Färbung (rot angefärbt) b) 3D-Darstellung eines 3 Tage alten P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa Wildtyp) – GFP Biofilm 6 c) 3D-Bild-Darstellung eines PAO1 – CFP pila Mutante (blau) mit einem PAO1 Wildtyp YFP (gelb) d) 5 Tage alten PAO1 – GFP Biofilm als 3D vorgestellt Bild e) 26 h S. cerevisiae (ptr3 Mutanten in CEN.PK Hintergrund) Biofilm mit Syto-9 15 gefärbt.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |