Protocolo que descreve a aplicação de um sistema de célula de fluxo para o cultivo e análise de biofilmes microbianos para Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM).
Células microbianas muitos têm a capacidade de formar comunidades microbianas sésseis definido como biofilmes que alteraram as propriedades fisiológicas e patológicas em comparação com microorganismos de vida livre. Biofilmes na natureza são muitas vezes difíceis de investigar e residir sob condições definidas mal 1. Usando um substrato transparente é possível a um dispositivo de sistema onde biofilmes simples podem ser analisados de forma não-destrutiva em tempo real: aqui demonstrar a montagem e operação de um sistema modelo de fluxo de células, para estudos in vitro de biofilmes microbianos em 3D gerando alta reprodutibilidade sob condições bem definidas 2,3.
O sistema consiste de uma célula de fluxo, que serve como câmara de crescimento para o biofilme. A célula de fluxo é fornecido com nutrientes e oxigênio a partir de um frasco médio através de uma bomba peristáltica e médio gasto é coletada em um recipiente de resíduos. Esta construção do sistema de fluxo permite um fornecimento contínuo de nutrientes e administração de antibióticos por exemplo, com o mínimo de perturbação das células cultivadas em câmara de fluxo. Além disso, as condições de fluxo dentro da célula de fluxo permitem estudos de biofilme expostos a tensão de cisalhamento. Uma bolha bolhas de interceptação dispositivo limites de ar da tubulação que de outra forma poderiam perturbar a estrutura do biofilme na célula de fluxo.
O sistema de célula de fluxo é compatível com Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM) e pode, assim, fornecer informações altamente detalhadas em 3D sobre o desenvolvimento de biofilmes microbianos. Células no biofilme podem ser rotulados com sondas fluorescentes ou proteínas compatível com a análise CLSM. Este permite a visualização on-line e permite investigação de nichos no desenvolvimento de biofilme. Inter-microbiana, a investigação de agentes antimicrobianos ou a expressão de genes específicos, são muitas das configurações experimentais que podem ser investigadas no sistema de célula de fluxo.
Temos demonstrado um sistema de célula de fluxo que representa uma poderosa ferramenta nas investigações biofilme. Combinado com imagens em 3D através de microscopia confocal, o sistema tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos de análise de biofilmes microbianos por meio dos mais tradicionais técnicas de microscopia. Este sistema permite a visualização 3D de vida das comunidades biofilme microbiano sem perturbação da comunidade. Microscopia de luz não fornecerá informações detalhadas sobre os nichos do biofilme e enquanto a microscopia eletrônica fornece uma resolução em nanoescala do biofilme, ele não permite que imagens de células vivas.
Usando o sistema de canais de fluxo descrito anteriormente elucidado temos a distribuição espacial das células bacterianas sensíveis a vários antibióticos 5-8 (Figura 4), a distribuição de compostos extracelulares, por exemplo, DNA e 11/09, a distribuição de células móveis e não móveis de mesma espécie dentro de uma comunidade bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Nós prevemos que o sistema de célula de fluxo pode ser usado para estudar os aspectos de biofilmes levedura. Esta pode ser a distribuição espaço temporal de biofilme levedura em resposta a fatores ambientais, tais como fungicidas, bem como a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme por leveduras. Apesar de levedura não se sabe se diferenciar em células móveis e não móveis, outros aspectos de diversificação biofilme podem ser estudos, tais como a mudança morfológica de levedura para as células e pseudohyphal a mudança de haplóides de células diplóides.
Nós mostramos um sistema que respeitar uma série de espécies microbianas e vai trabalhar com várias técnicas de coloração. Uma variedade de sondas de coloração diferente e proteínas fluorescentes, como o GFP, a possibilitar a investigação nicho específico no biofilme em desenvolvimento e é uma ferramenta eficiente para analisar o efeito de agentes antimicrobianos ou outros fatores ambientais. A informação que pode ser adquirida é muito detalhado (Figura 4) e recursos do biofilme pode ser quantificado com programas de computador, tais como COMSTAT 12,13.
No geral, o aspecto mais crítico do protocolo é o fato de que é um processo demorado. É também uma limitação de que as células precisam ser capazes de crescer em uma superfície não fluorescente, transparente. . Desde a formação de biofilmes é analisada utilizando um microscópio confocal, a profundidade que pode ser investigado é limitada a algumas centenas de micrômetros de 14 Há ainda limitações técnicas inerentes ao projeto: o sistema não é adequado para triagem de alto rendimento, como um investigador experiente pode lidar com no máximo cerca de 15 canais por experiência, que por sua vez pode levar vários dias para se preparar. No entanto, antibióticos ou mutantes que são consideradas relevantes para estudos de biofilmes pode ser inicialmente massa rastreados com outros métodos, como a coloração violeta cristal antes de os candidatos mais interessantes são transferidos para o sistema de célula de fluxo. As folhas de cobertura de vidro são muito finos e se quebram facilmente, e cuidados devem ser tomados no manuseio dos sistemas. Além disso, os tubos devem ser examinados diariamente durante a execução de um experimento, como considerável "de volta o crescimento" nos tubos de entrada logo acima das células de fluxo pode ocorrer. Esta contaminação pode ser resolvido através da remoção de vários centímetros de tubo de silicone do lado de entrada das células de fluxo, usando técnica estéril.
Figura 4 a PAO1) quatro dias de idade -. GFP biofilme tratadas por 24h com Colistina e iodeto de propídio para a coloração de mortos (mancha vermelha) b) apresentação em 3D de um de três dias de idade P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa tipo selvagem) – GFP biofilme 6 c) apresentação 3D imagem de um PAO1 – PCP pila mutante (azul) com um tipo selvagem PAO1 YFP (amarelo) d) 5 dias PAO1 idade – GFP biofilme apresenta-se como um 3D e imagem) 26 h S. biofilme cerevisiae (PTR3 mutante em CEN.PK fundo) corados com Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |