Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
DNA hasarı varlığı Yanlış çoğaltma ve yaygın olarak insanlarda kanser gelişimi ile doğrudan ilişkili olduğuna inanılan tüm hücre tiplerinde gözlenen hücresel düzenlenmeleri ve mutagenez çoğunluk için sorumludur. DNA hasarı, UV ışını ile indüklenen gibi ciddi doğru genomik şablonu çoğaltmak çoğaltma yeteneğini bozar. Bir dizi gen ürünleri çoğaltma şablon DNA lezyonlar karşılaştığında gerekli olduğu tespit edilmiştir. Ancak, kalan meydan çoğaltma sırasında bu proteinlerin nasıl süreci lezyonları belirlemek olmuştur<em> In vivo</em>. Escherichia coli bir model sistem olarak kullanarak, iki boyutlu agaroz-jel analizi kopyalayan plazmid ortaya çıkan yapısal ara tanımlamak için kullanılabilecek bir prosedür tarif<em> In vivo</em> UV ışınlarına bağlı DNA hasarını. Bu prosedür, UV hasarına tarafından bloke çoğaltma çatal, reca ve RecF yolağı ile ilişkili çeşitli gen ürünleri tarafından stabilize geçici bir ters tabi olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, bu çoğaltma ara nükleotid eksizyon onarımı ve çoğaltma devam eder lezyonların kaldırılması ile ilişkilendiren bir saatine kadar korunur olduğunu gösteriyor.
Protocol
1. Büyüme ve UV Işınlama. Şekeri% 0.4,% 0.2 casamino asitler, ve 10 mg / ml timin (DGCthy orta) ve 100 mg / ml ampisilin ile desteklenmiş Davis orta 1 yetiştirilen plazmid pBR322 içeren taze bir gece kültür 200μl pelet. Hücre pelletini sonra ampisilin eksik 200μl DGCthy orta yeniden bekletildi ve 20 ml DGCthy orta aşılamak için kullanılır. Kültürler 0.5 OD 600 (~ 5 x 10 8 hücre / ml) 37 sallayarak inkübatör ampisilin seçimi ° C olmadan yetiş…
Discussion
UV hasarına varlığı ve yokluğu vahşi tip hücreler elde edilen tipik sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Hasar yokluğunda, hücreler üstel fazda hızla büyüyor ~% 1, toplam plazmid DNA Y ark. Bloke çoğaltma çatal hasarlı siteleri biriktikçe ışınlama takiben, Y şekilli moleküllerin geçici bir artış görülmektedir. X-şeklinde çoğaltma ara lezyonlar tamir ile ilişkilendiren bir saatine kadar geçici olarak birikir ve devam.
Güney analizi yerine, çoğaltma a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuarımızda NIGMS-Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı ve ALANI hibe R15GM86839 KARİYER ödül MCB0551798 tarafından desteklenmektedir.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed
Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2220, doi:10.3791/2220 (2010).