에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여
Summary
우리는 2 차원 아가로 오스 겔 – 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.
Abstract
DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다<em> 생체내에</em>. 모델 시스템으로 대장균을 사용하여, 우리는 2 차원 아가로 오스 겔 – 분석 복제 plasmids에 발생하는 구조 중간체를 식별하는 데 사용할 수있는 절차를 설명<em> 생체내에</em> UV – 유도된 DNA 손상에 따라. 이 절차는 UV – 유발 손상에 의해 차단 복제 포크가 RecA와 RecF 경로와 관련된 여러 유전자 제품에 의해 안정화되는 과도 반전을 받다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 기술이 복제 중간체는 뉴클레오 티드 절단 수리 및 복제 다시 시작하여 병변의 제거와 상호 때까지 유지됩니다 보여줍니다.
Protocol
Discussion
UV – 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X – 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리가 실험실에서 작업이 NIGMS – NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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