Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.
Abstract
Неточный репликации в присутствии ДНК является причиной большинства сотовых перестановок и мутагенеза наблюдается во всех типах клеток, и многие считают, непосредственно связанные с развитием рака у людей. Повреждение ДНК, как, например, индуцированной УФ-излучением, сильно снижает способность репликации дублировать геномной шаблон точно. Ряд продуктов генов были идентифицированы, которые необходимы при репликации встреч повреждений ДНК в шаблоне. Тем не менее, остающиеся проблемы в том, чтобы определить, как эти повреждения белков процесс во время репликации<em> В естественных условиях</em>. Использование кишечной палочки в качестве модельной системы, мы опишем процедуру, в которой двумерная агарозном гель-анализ может быть использован для выявления структурных промежуточных, которые возникают на репликацию плазмид<em> В естественных условиях</em> Следующий УФ-индуцированного повреждения ДНК. Эта процедура была использована, чтобы продемонстрировать, что репликация вилки заблокирован УФ-индуцированного повреждения пройти переходный разворота, которая стабилизируется RecA и нескольких продуктов гена, связанного с пути RecF. Техника показывает, что эти промежуточные репликации, сохраняются до времени, что коррелирует с удалением от поражения нуклеотидных репарации и репликации возобновляется.
Protocol
1. Рост и УФ-облучения. 200 мкл свежей ночной культуры содержащие плазмиды pBR322 выросли в Дэвисе среду 1 дополнена с 0,4% глюкозы, 0,2% casamino кислоты и 10 мкг / мл тимин (DGCthy среды) и 100 мкг / мл ампициллина является гранулированный. Осадок клеток, затем ресуспендировали в 200 мкл среды DGCthy ?…
Discussion
Типичные результаты, полученные от дикого типа клетки в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения показаны на рисунке 1. При отсутствии повреждений, ~ 1% от общей плазмидной ДНК можно найти в дуге Y, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе. После облучения, прех…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке КАРЬЕРА награду MCB0551798 от Национального научного фонда и грант ОБЛАСТЬ R15GM86839 от NIGMS-NIH.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed
Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2220, doi:10.3791/2220 (2010).