نقدم الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام تحليل لتحديد هيكل وسيطة النسخ التالية التي تحدث للاشعة فوق البنفسجية.
Abstract
النسخ غير دقيقة في وجود الحمض النووي من التلف هي المسؤولة عن غالبية إعادة ترتيب الخلوية والطفرات التي لوحظت في جميع أنواع الخلايا ، ويعتقد على نطاق واسع لتكون مرتبطة مباشرة مع تطور السرطان لدى البشر. الحمض النووي من التلف ، مثل تلك التي تسببها أشعة فوق البنفسجية ، ويضعف بشدة قدرة تكرار لتكرار قالب الجينومية بدقة. وقد تم تحديد عدد من المنتجات التي يتم الجينات المطلوبة عند تكرار اللقاءات آفات الحمض النووي في القالب. ومع ذلك ، فقد كان التحدي المتبقية لتحديد كيفية معالجة هذه الآفات البروتينات أثناء النسخ المتماثل<em> في الجسم الحي</em>. باستخدام القولونية كنظام النموذج ، فإننا وصف الإجراء الذي يمكن أن تستخدم ثنائي الأبعاد agarose هلام التحليل من أجل تحديد وسيطة الهيكلية التي تنشأ عن تكرار البلازميدات<em> في الجسم الحي</em> التالي الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف الحمض النووي. وقد استخدم هذا الإجراء لإثبات أن تتفرع تكرار حظره بواسطة الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها الضرر الخضوع لانعكاس عابر أن استقرت RecA والمنتجات الجينات المرتبطة عدة المسار RecF. أسلوب يدل على أن تتم المحافظة على هذه سيطة النسخ المتماثل حتى الوقت الذي يرتبط مع إزالة الآفات إصلاح الختان النوكليوتيدات واستئناف النسخ المتماثل.
Protocol
1. النمو والإشعاع فوق البنفسجي. 200μl ثقافة جديدة بين عشية وضحاها التي تحتوي على البلازميد pBR322 نمت في المتوسط ديفيس 1 تستكمل مع السكر بنسبة 0.4 ٪ ، 0.2 ٪ الأحماض casamino ، و 10 ميكروغرام / مل الثايمين (DGCthy متوسطة) و 100 ميكر…
Discussion
وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها من خلايا نموذجية النوع البري في حضور وغياب الأشعة فوق البنفسجية التي يسببها تلف في الشكل 1. في غياب أي ضرر ، ويمكن العثور ~ 1 ٪ من الحمض النووي للبلازميد الإجمالي في قوس Y عندما الخلايا تنمو بسرعة في مرحلة الأسي. بعد التشعيع ، لوحظ زياد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر لدينا من قبل جائزة التوظيف MCB0551798 من المؤسسة الوطنية للعلوم ومنطقة منحة R15GM86839 من NIGMS – NIH.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed
Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis. J. Vis. Exp. (46), e2220, doi:10.3791/2220 (2010).