Summary

Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.

Abstract

İnsan hematopoietik kök / progenitör hücreleri genellikle kemik iliği, kordon kanı veya periferik kandan elde edilen ve hemopoeziste ve leukemogenesis incelemek için kullanılır. Bunlar lenfoid ve myeloid soyları ayırt etmek için kapasite var. Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini, yarı katı bir ortamda koloniler oluşturmak için yeteneklerini proliferasyon ve farklılaşma desen hematopoetik atalarıdır çalışma kullanılır. Sabit bir sayıda giriş hücrelerinin oluşturduğu kolonilerin sayısı ve morfolojisi ayırt etmek atalarıdır yeteneği hakkında ön bilgi vermek ve çoğalırlar. Hücreler bireysel koloniler veya bütün plaka numaraları ve akım sitometri ve Giemsa lekeli dia morfolojik değerlendirme kullanarak farklılaşma devletler daha da değerlendirmek için hasat edilebilir. Bu testte, ama lenfoid değil miyeloid farklılaşma değerlendirmek için yararlıdır. Bu bağlamda vadeli miyeloid granülositik, monositik, eritroid ve megakaryocytic soy kapsayacak şekilde daha geniş anlamda kullanılır.

Biz periferik kandan elde edilen birincil insan CD34 + hücre farklılaşması onkogenler etkilerini değerlendirmek için bu testte kullandık. Bu amaçla hücreler için NUP98-HOXA9 Bu durumda, kontrol retroviral inşa veya ilgi onkogen ifade bir yapı ile transduced. Biz, ilgi ve GFP işaretleyici gen üreten bir bicistronic mRNA ifade yaygın olarak kullanılan bir retroviral vektör, MSCV IRES-GFP, istihdam etmektedir. Hücreler sitokinlerin varlığında retroviral transdüksiyon öncesinde iki gün boyunca büyüyerek önceden aktive edilir. Bir iki gün sonra, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) GFP + hücreler izole edilir ve sitokinler ile desteklenmiş ve koloniler genellikle yüzey, 14 gün kadar inkübe metilselüloz içeren yarı katı orta ile karışık. Kolonilerin sayısı ve morfolojisi belgelenmiştir. Hücreler daha sonra plakalar kaldırılır yıkanmış sayılır ve akım sitometri ve morfolojik inceleme tabi. Flow sitometri hematopoez sırasında ifade edilen hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile soy ve olgunlaşma aşamasında hakkında bilgi sağlar. Wright-Giemsa boyama sonrası mikroskop altında tek tek hücrelerin morfolojik çalışmalar, soy ve olgunlaşma ile ilgili daha fazla bilgi sağlar. Hücrelerin karşılaştırılması bir onkogen hematopoetik farklılaşma onkogen etkileri açığa transduced bu boş vektör kontrolü ile transduced.

Protocol

1. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI Fms ilgili tirozin kinaz 3 steril 1000x stok çözelti hazırlayın (FLT-3) ligand, makrofaj / granülosit koloni-interlökin (IL) -3 uyarıcı faktör (GM-CSF), kök hücre faktörü (SCF), trombopoetin (TPO), ve IL-6, üreticinin talimatlarına göre. Steril Retronectin stok solüsyonu (1mg/ml) da üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Küçük alikotları bu stok çözümleri Böl ve tekrarlanan donma-çözülme önlemek için -20 ° C'de tutmak. IMDM i?…

Discussion

CFC tahlil hematopoetik atalarıdır çoğalmasını ve farklılaşmasını modellerini belirlemek ve onkogenler (4, 5) etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koloniler tek bir progenitör soyu temsil eden ve ileri analiz için ayrı ayrı kaldırılabilir klonal bir tahlil, sıvı kültürler üzerinde bir avantaja sahiptir. Bu tür hücreler kullanılarak tespit edilir, uzun vadeli bir kültür başlatan hücre (LTC-IC) assay (6, 7). CFC testinin sınırlama, daha olgunlaşmamış atalarıdı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz flow sitometri cihazı ve sıralama hizmetleri sağlanan Yüksek Hızlı Hücre Sıralayıcısı Çekirdek, kullanmak için teşekkür Alvin J. Siteman Kanser Merkezi, Washington Üniversitesi Tıp ve St Louis, MO Barnes Yahudi Hastanesi. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants R01 HL082549 ve K02 HL084179 (NRY) tarafından desteklenmiştir. Siteman Kanser Merkezi, NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA91842 tarafından kısmen destekleniyor.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

Play Video

Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

View Video