Колония Формирование Cell (CFC) Пробирной по правам гемопоэтических клеток
Summary
Колониеобразующих клетки (CFC) анализа является в пробирке тест, в котором кроветворные предшественники образовывать колонии в полутвердой среде. Сочетание колонии морфологии, морфологии клеток, и проточной цитометрии используются для оценки способности к пролиферации предшественников и дифференцировать по различным гемопоэтических линий.
Abstract
Человек гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток, как правило, полученные из костного мозга, пуповинной крови, или периферической крови и используются для изучения кроветворения и возникновение и развитие лейкоза. Они обладают способностью дифференцироваться в лимфоидной и миелоидной линий. Колониеобразующих клетки (CFC) анализ используется для изучения пролиферации и дифференцировки гемопоэтических шаблон прародителей по их способности образовывать колонии в полутвердой среде. Количество и морфология колоний образована фиксированное число входных клетки обеспечивают предварительную информацию о способности прародителей дифференцировать и размножаться. Клетки могут быть собраны из отдельных колоний или целую тарелку для дальнейшей оценки их численности и дифференциация состояний с помощью проточной цитометрии и морфологической оценки Гимза окрашенных слайдов. Этот анализ используется для оценки миелоидной но не лимфоидной дифференцировки. Термин миелоидной в данном контексте используется в более широком смысле, чтобы охватить гранулоцитарного, моноцитов, эритроидных и megakaryocytic линий.
Мы использовали этот анализ для оценки влияния онкогенов на дифференциацию первичных человеческих CD34 + клетки, полученные из периферической крови. Для этого клетки трансдуцированных либо контроль ретровирусных построить или построить выражения онкоген интерес, в данном случае NUP98-HOXA9. У нас работают обычно используется ретровирусных вектор, MSCV-IRES-GFP, который выражает bicistronic мРНК, которая производит ген интереса и маркера GFP. Клетки предварительно активируется росту в присутствии цитокинов в течение двух дней до ретровирусной трансдукции. Еще через два дня, GFP + клеток изолированы флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) и в смеси с метил-содержащих полутвердых среде, дополненной цитокинов и инкубировали до колонии появляются на поверхности, как правило, 14 дней. Количество и морфология колоний документируются. Затем клетки удаляются из пластин, промывают, подсчитываются и подвергали проточной цитометрии и морфологические исследования. Проточная цитометрия с антителами, специфичными к поверхности клеток маркеры, высказанных в ходе кроветворения предоставляет информацию о линии и созревания. Морфологические исследования отдельных клеток под микроскопом после Райта-Гимза окрашивания предоставить дополнительную информацию в отношении происхождения и созревания. Сравнение клеток трансдуцированных с управлением пустой вектор тем трансдуцированных с онкоген показывает последствия онкоген на гемопоэтических дифференциации.
Protocol
Discussion
Анализ ХФУ широко используется для определения пролиферации и дифференцировки гемопоэтических моделей прародителей и изучать эффекты онкогенов (4, 5). Его преимущество над жидким культуры бытия клонального анализа, например, что колонии представляют собой потомство одной предшествен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
