Summary

Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.

Abstract

Humaines hématopoïétiques cellules souches / progénitrices sont généralement obtenus à partir de la moelle osseuse, sang du cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l'hématopoïèse et la leucémogenèse. Ils ont la capacité de se différencier en lignées lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est utilisé pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs tendance hématopoïétique par leur capacité à former des colonies dans un milieu semi-solide. Le nombre et la morphologie des colonies formées par un nombre fixe de cellules d'entrée fournir des informations préliminaires sur la capacité des progéniteurs de différencier et de proliférer. Les cellules peuvent être récoltées à partir des colonies individuelles ou de la plaque entière pour mieux évaluer leur nombre et les états de différenciation par cytométrie en flux et l'évaluation morphologique de Giemsa lames colorées. Ce test est utile pour évaluer la différenciation myéloïde mais pas lymphoïdes. Le myéloïde terme dans ce contexte est utilisé dans son sens large pour englober lignées granulocytaire, monocytaire, érythroïdes et mégacaryocytaires.

Nous avons utilisé ce test pour évaluer les effets des oncogènes sur la différenciation des primaires humaines dérivées de cellules CD34 + du sang périphérique. Pour cette fin sont les cellules transduites avec le contrôle de construire soit rétroviraux ou une construction exprimant l'oncogène d'intérêt, dans ce cas-NUP98 HOXA9. Nous employons un vecteur rétroviral couramment utilisés, MSCV-IRES-GFP, qui exprime un ARNm bicistronique qui produit le gène d'intérêt et un marqueur de la GFP. Les cellules sont pré-activés par de plus en plus la présence de cytokines pendant deux jours avant transduction rétrovirale. Après deux jours, les cellules GFP + sont isolés par tri cellulaire par fluorescence (FACS) et mélangé avec un milieu semi-solide contenant méthylcellulose complétées par des cytokines et incubés jusqu'au colonies apparaissent à la surface, généralement 14 jours. Le nombre et la morphologie des colonies sont documentés. Les cellules sont ensuite retirés des plaques, lavés, comptés, et soumis à la cytométrie en flux et l'examen morphologique. La cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques à la surface cellulaire des marqueurs exprimés au cours de l'hématopoïèse fournit des informations sur la lignée et le stade de maturation. Des études morphologiques des cellules individuelles au microscope après coloration de Wright-Giemsa fournir des informations supplémentaires à l'égard de la lignée et la maturation. Comparaison des cellules transduites avec le vecteur contrôle vide à ceux transduites avec un oncogène révèle les effets de l'oncogène sur la différenciation hématopoïétique.

Protocol

1. PREPARATION DES REACTIFS Préparer des solutions stériles stock de 1000x de FMS liées tyrosine kinase 3 (FLT-3) ligand, granulocytes / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), stem cell factor (SCF), la thrombopoïétine (TPO), l'interleukine (IL) -3 , et l'IL-6 conformément aux instructions du fabricant. Préparer une solution stérile d'actions Retronectin (1mg/ml) aussi selon les instructions du fabricant. Divisez ces solutions de stock en petites fractions aliquotes et de garder à…

Discussion

Le dosage de CFC a été largement utilisée pour déterminer la prolifération et la différenciation des modèles de progéniteurs hématopoïétiques et d'étudier les effets des oncogènes (4, 5). Il a l'avantage sur les cultures de liquide d'être un test clonal, telles que les colonies constituent la descendance d'un ancêtre unique et peut être retiré individuellement pour une analyse ultérieure. La limitation du dosage de CFC est qu'elle n'est pas adéquate pour la détection de progé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le juge Alvin Siteman Cancer Center à Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St Louis, MO, pour l'utilisation de la base Trieuse vitesse élevée de cellules, qui a fourni l'équipement et des services de cytométrie en flux de tri. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions et de santé R01 HL082549 K02 HL084179 (NRY). Le Siteman Cancer Center est soutenu en partie par un soutien du NCI Cancer Center Grant P30 CA91842.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

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Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

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