셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.
인간 조혈 줄기 / 전구 세포는 보통 골수, 코드 혈액, 또는 주변 혈액에서 얻은 있으며, 조혈 및 leukemogenesis을 연구하는 데 사용됩니다. 그들은 림프 및 골수양 lineages로 차별화하는 능력이 있습니다. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 semisolid 매체 식민지를 형성하는 능력에 의해 증식 및 조혈 progenitors의 차별 패턴을 연구하는 데 사용됩니다. 입력 세포의 고정 숫자에 의해 형성된 콜로니의 숫자와 형태 차별 progenitors의 능력에 대한 사전 정보를 제공하고 세포 분열 따위에 의해 번식. 전지는 더욱 자신의 번호와 유동세포계측법 및 Giemsa 묻은 슬라이드 morphologic 평가를 사용하여 차별 상태를 평가하기 위해 각각의 식민지에서 또는 전체 접시에서 수확 수 있습니다. 이 분석은 골수양하지만 림프하지 차별을 평가하는 데 유용합니다. 이 맥락에서 용어 골수양는 granulocytic, monocytic erythroid 및 megakaryocytic lineages을 포괄하기 위해 넓은 의미에서 사용됩니다.
우리는 주변 혈액에서 파생 기본 인간의 CD34 + 세포의 분화에 oncogenes의 효과를 평가하기 위해이 분석을 사용했습니다. 이러한 목적 세포에 대한이 사건 NUP98 – HOXA9에서, 제어 retroviral 구조 또는 관심의 oncogene을 표현하는 구성 하나와 transduced 있습니다. 우리는 관심과 GFP 표지의 유전자를 생산하는 bicistronic mRNA를 표현 일반적으로 사용되는 retroviral 벡터, MSCV – IRES – GFP를 사용합니다. 세포 retroviral 전달하기 전에 이틀 동안 크린 시토킨의 면전에서 성장하여 미리 활성화됩니다. 또 이틀 뒤에는, GFP + 세포는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)에 의해 격리되며 크린 시토킨로 보충하고 식민지는 일반적으로 표면을 14 일에 나타날 때까지 incubated 메틸 셀룰로오스 함유 semisolid 매체와 혼합. 식민지의 개수와 형태가 설명되어 있습니다. 세포는 다음 접시에서 제거 씻어, 계산 및 유동세포계측법 및 morphologic 심사를 받게됩니다. 조혈 동안 표현 세포 표면 마커 특정 항체와 유동세포계측법는 가계와 성숙 단계에 대한 정보를 제공합니다. 라이트 – Giemsa의 얼룩 후 현미경으로 각각의 세포의 형태학의 연구는 혈통과 성숙에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 세포의 비교 oncogene 조혈 차별에 oncogene의 효과를 밝혀와 transduced들에게 빈 벡터 제어와 transduced.
CFC의 분석은 조혈 progenitors의 확산과 차별의 패턴을 결정하고 oncogenes의 효과를 (4, 5) 연구에 광범위하게 사용되고 있습니다. 그것은 식민지가 단일 조상의 자손을 나타내는 개별적으로 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다 그러한 clonal 분석,되는 액체 문화 이상의 장점이 있습니다. 이러한 전지는 사용 감지 장기적인 문화 시작 셀 (LTC – IC) 분석 (6, 7). CFC 분석의 한계는 더 어려서 progenitors 또는 조…
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
SCF | Peprotech | 300-07 | ||
TPO | Peprotech | 300-18 | ||
IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
PBS | Life Technologies | 14200 | ||
Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
Microscope | Olympus | BX51 | ||
Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |