Summary

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Abstract

Humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras células são normalmente obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico e são usados ​​para estudar a hematopoiese e leukemogenesis. Eles têm a capacidade de se diferenciar em linhagens linfóide e mielóide. O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é utilizado para estudar o padrão de proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoéticas por sua capacidade de formar colônias em meio semi-sólido. O número ea morfologia das colônias formadas por um número fixo de células de entrada fornecer informações preliminares sobre a capacidade dos progenitores para se diferenciar e proliferar. As células podem ser colhidas a partir de colônias individuais ou de toda a placa para melhor avaliar os seus números e os estados de diferenciação por citometria de fluxo e avaliação morfológica de Giemsa-manchada slides. Este ensaio é útil para avaliar a diferenciação mielóide, mas não linfóides. O mielóide termo neste contexto é usada em seu sentido mais amplo para abranger linhagens granulocítica, monocítica, eritróide e megacariocítica.

Temos utilizado neste ensaio para avaliar os efeitos de oncogenes na diferenciação de humanos primários células CD34 + derivadas do sangue periférico. Para este fim são as células transduzidas com qualquer construção de controle retroviral ou uma construção expressando o oncogene de interesse, neste caso NUP98-HOXA9. Nós empregamos um vetor retroviral comumente usados, MSCV-IRES-GFP, que expressa um mRNA bicistronic que produz o gene de interesse e um marcador GFP. Células são pré-ativado pelo crescimento na presença de citocinas por dois dias antes de transdução retroviral. Após mais dois dias, as células GFP + são isolados por fluorescência-activated cell sorting (FACS) e misturado com um meio de metilcelulose contendo semi-sólido suplementado com citocinas e incubados até colônias aparecem na superfície, geralmente 14 dias. O número e morfologia das colônias são documentados. Células são então removidas das placas, lavados, contados, e submetido a citometria de fluxo e análise morfológica. Citometria de fluxo com anticorpos específicos para os marcadores de superfície celular, expressas durante a hematopoiese fornece informações sobre a linhagem e maturação. Estudos morfológicos de células individuais sob um microscópio após Wright-Giemsa coloração fornecer informações adicionais em relação a linhagem e maturação. Comparação das células transduzidas com controle de vetores vazios aos transduzidas com um oncogene revela os efeitos do oncogene na diferenciação hematopoiética.

Protocol

1. PREPARAÇÃO DE REAGENTES Prepare estéril soluções estoque de 1000x Fms relacionados tirosina quinase 3 (FLT-3) ligando, estimulante de colônias de granulócitos / macrófagos factor (GM-CSF), fator de células tronco (SCF), trombopoietina (TPO), interleucina (IL) -3 e IL-6 de acordo com instruções do fabricante. Preparar a solução estoque estéril Retronectin (1mg/ml) também de acordo com instruções do fabricante. Dividir estas soluções estoque em pequenas alíquotas e manter a -20 ° C para …

Discussion

O ensaio de CFC tem sido amplamente utilizado para determinar a proliferação e os padrões de diferenciação de células progenitoras hematopoéticas e estudar os efeitos dos oncogenes (4, 5). Tem a vantagem sobre culturas líquidas de ser um ensaio clonal, de tal forma que as colônias representam a progênie de um único progenitor e podem ser removidos individualmente para análise posterior. A limitação do ensaio CFC é que ele não é adequado para a detecção de células progenitoras imaturas ou mais célula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Alvin J. Siteman Cancer Center, em Washington University School of Medicine e Barnes-Jewish Hospital, em St Louis, MO, para o uso da Alta Velocidade Núcleo Sorter Cell, que forneceu equipamentos de citometria de fluxo e serviços de classificação. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants R01 HL082549 e K02 HL084179 (NRY). O Siteman Cancer Center é suportado, em parte, por um suporte NCI Centro de Câncer Grant P30 CA91842.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

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Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

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