In questo articolo, abbiamo descritto un modo tipico per isolare e cultura miociti adulti cuore di ratto. Collagenasi e proteasi sono utilizzati da digerire e isolare singoli miociti. Miociti colto seguire questo protocollo soddisfare le esigenze più sperimentare.
Abstract
Coltura primaria adulto cellule del cuore roditori sono un modello di sistema importante per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, la creazione di robusti, miociti vitali adulto colto può essere tecnicamente impegnativo, fattore limitante per molti ricercatori. Qui abbiamo descritto un protocollo per ottenere un elevato rendimento di miociti adulti cuore di ratto che rimangono vitali in coltura per diversi giorni. Il cuore è isolato e perfuso con collagenasi e proteasi in basso Ca<sup> 2 +</sup> Condizioni di recuperare singoli miociti. Ca<sup> 2 +</sup>-Tolerant cellule sono ottenute da un aumento graduale in extracellulare Ca<sup> 2 +</supConcentrazione> in tre successive fasi di lavaggio. Le cellule sono filtrati, risospeso in terreno di coltura, e placcato sulla scivola laminina rivestito. Miociti in coltura ottenuti usando questo protocollo sono vitali per un massimo di quattro giorni e sono adatti per la maggior parte degli esperimenti tra cui elettrofisiologia, biochimica, biologia molecolare e di imaging.
Protocol
Parte I. Preparazione per la chirurgia Il giorno prima della chirurgia ratto, accertarsi che tutte le soluzioni sono fatti, ma non aggiungere alcun enzimi ancora. Buffer A, B e il tampone di lavaggio dovrebbero essere filtrate per la sterilità prima di stoccaggio. I tamponi dovrebbero essere conservato a 4 ° C. 6-pozzetti colture di tessuti deve essere placcato con 10-20 mg / mL laminina in 2 ml 1XSFM il giorno prima come bene, e deve essere conservato a 37 ° C in un incubatore CO 2. <…
Discussion
Un passo fondamentale è la velocità con cui è appeso il cuore isolato sul sistema di perfusione. La durata del periodo di digestione enzimatica può essere un po 'diverso per ogni ratto. La regolazione dipende da come il cuore diventa morbida dopo il periodo normale di digestione. Il piano di recupero di Ca 2 + dopo la digestione enzima è essenziale per ottenere le cellule sane Ca 2 +-tollerante.
Per la cavia, il protocollo è lo stesso, tranne ialuronidasi vien…