In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.
Abstract
Gekweekte primaire volwassen knaagdieren hart-cellen zijn een belangrijk model voor cardiovasculair onderzoek. Toch kunnen stellen en daarvoor solide, levensvatbare gekweekte volwassen myocyten wordt een technisch uitdagende, snelheidsbeperkende stap voor vele onderzoekers. Hier hebben we beschreven een protocol om een hoge opbrengst van volwassen ratten hart myocyten dat levensvatbaar te blijven in de cultuur gedurende enkele dagen te verkrijgen. Het hart is geïsoleerd en geperfuseerd met collagenase en protease onder lage Ca<sup> 2 +</sup> Voorwaarden om een myocyten herstellen. Ca<sup> 2 +</sup>-Tolerante cellen zijn verkregen door de stapsgewijze verhoging van extracellulaire Ca<sup> 2 +</sup> Concentratie in drie opeenvolgende wasstappen. Cellen worden gefilterd, geresuspendeerd in kweekmedium, en uitgeplaat op laminine gecoat enten. Verkregen gekweekt myocyten gebruik van dit protocol levensvatbaar zijn voor maximaal vier dagen en zijn geschikt voor de meeste experimenten, inclusief de elektrofysiologie, biochemie, beeldvorming en moleculaire biologie.
Protocol
Deel I. Voorbereiding voor een operatie De dag voor de rat operatie, er zeker van dat alle oplossingen worden gemaakt, maar nog geen enzymen. Buffers A, B en de wasbuffer moeten alle worden gefilterd voor steriliteit voorafgaand aan de opslag. De buffers moeten allemaal worden bewaard bij 4 ° C. 6-well kultuurplaten moeten worden bedekt met 10-20 ug / ml laminine in 2 ml 1XSFM de dag ervoor ook, en moet worden bewaard bij 37 ° C in een CO 2 incubator. Op de dag van de operatie…
Discussion
Een kritische stap is de snelheid waarmee de geïsoleerde hart wordt opgehangen op het perfusie-systeem. De lengte van de enzymatische vertering periode kan een beetje verschillend voor elke rat. De aanpassing is afhankelijk van hoe zacht het hart wordt na de reguliere periode van de spijsvertering. De langzaam herstel van de Ca 2 + na-enzym digestie is essentieel voor het verkrijgen van Ca 2 +-tolerante gezonde cellen.
Voor de cavia, het protocol is hetzelfde, behalve …