In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.
Abstract
Cultured primäre erwachsenen Nagetieren Herzzellen sind ein wichtiges Modellsystem für Herz-Kreislauf-Forschung. Dennoch können Etablierung von robusten, tragfähigen kultivierten adulten Myozyten eine technisch anspruchsvolle, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt für viele Forscher. Hier haben wir beschrieben, ein Protokoll zu einer hohen Ausbeute an erwachsenen Ratte Herz Myozyten, die lebensfähig bleiben in der Kultur für mehrere Tage zu erhalten. Das Herz ist isoliert und perfundiert mit Kollagenase und Protease unter niedrigen Ca<sup> 2 +</sup> Bedingungen zu erholen einzelnen Myozyten. Ca<sup> 2 +</sup>-Tolerante Zellen sind durch schrittweise Erhöhung der extrazellulären Ca erhalten<sup> 2 +</sup> Konzentration in drei aufeinander folgenden Waschschritten. Die Zellen werden gefiltert, in Kulturmedium resuspendiert und plattiert auf Laminin beschichteten rutscht. Cultured Myozyten erhalten mit diesem Protokoll sind lebensfähig für bis zu vier Tage und sind für die meisten Experimente einschließlich Elektrophysiologie, Biochemie, Imaging-und Molekularbiologie geeignet.
Protocol
Teil I. Vorbereitung für die Chirurgie Am Tag vor der Ratte Chirurgie, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen hergestellt werden, aber fügen Sie keine Enzyme noch. Puffer A, B und der Waschpuffer sollten alle für die Sterilität gefiltert werden, bevor Lagerung. Die Puffer sollten alle bei 4 ° C gelagert werden 6-well-Zellkulturplatten muss mit 10-20 pg / mL Laminin in 2 mL 1XSFM am Vortag sowie beschichtet werden, und sollte bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator gelagert werden. …
Discussion
Ein entscheidender Schritt ist die Geschwindigkeit, mit der das isolierte Herz auf der Perfusion System eingehängt ist. Die Länge der enzymatische Verdauung Zeitraum kann ein wenig anders für jede Ratte. Die Einstellung hängt davon ab, wie weich das Herz wird nach der regulären Zeit der Verdauung. Die langsam Erholung der Ca 2 + nach Enzymverdau unerlässlich für den Erhalt von Ca 2 +-tolerant gesunden Zellen ist.
Für Meerschweinchen, ist das Protokoll, das gleic…