Culture primaire des adultes myocytes cœur de rat
Summary
Dans ce papier, nous avons décrit d'une manière typique à isoler et cultiver les myocytes cardiaques de rat adulte. Collagénase et la protéase sont utilisés pour digérer et d'isoler les myocytes unique. Myocytes cultivés suivre ce protocole répondent aux exigences les plus expérimenter.
Abstract
Culture primaire de cellules adultes rongeurs cœur sont un système modèle important pour la recherche cardiovasculaire. Néanmoins, l'établissement de solides, viables myocytes adultes cultivés peut être un défi technique, étape limitante de nombreux chercheurs. Ici, nous avons décrit un protocole pour obtenir un rendement élevé d'adultes myocytes cardiaques de rat qui demeurent viables en culture pendant plusieurs jours. Le cœur est isolé et perfusé avec de la collagénase et la protéase sous faible teneur en Ca<sup> 2 +</sup> Conditions de récupérer les myocytes unique. Ca<sup> 2 +</sup> Tolérant cellules sont obtenues par augmentation progressive de la Ca extracellulaire<sup> 2 +</supConcentration> en trois étapes de lavage subséquentes. Les cellules sont filtrées, remis en suspension dans un milieu de culture, et plaquées sur les feuillets laminine couché. Myocytes cultivés obtenus en utilisant ce protocole sont viables pour un maximum de quatre jours et sont adaptés à la plupart des expériences dont l'électrophysiologie, biochimie, l'imagerie et de biologie moléculaire.
Protocol
Discussion
Une étape essentielle est la vitesse avec laquelle le cœur isolé est accroché sur le système de perfusion. La longueur de la période de digestion enzymatique peut être un peu différent pour chaque rat. L'ajustement dépend de la manière douce le cœur devient après la période régulière de la digestion. La reprise lente de Ca 2 + après digestion enzymatique est essentielle pour l'obtention de Ca 2 +-tolérants aux cellules saines.
Pour cochon de Gui…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
