Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.
Abstract
Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp se estabeleceu como uma técnica extremamente úteis para a aferição eletrofisiológica de canais de iões simples ou múltiplas nas células. Esta técnica pode ser aplicada a canais iônicos tanto no ambiente de sua nativa e expresso em células heterólogas, como oócitos colhidos o sapo com garras Africano, Xenopus laevis. Aqui, descrevemos a técnica bem estabelecida de gravação de patch-clamp de oócitos Xenopus. Esta técnica é utilizada para medir as propriedades de canais iônicos, expressos quer em populações (macropatch) ou individualmente (single-channel de gravação). Nós nos concentramos em técnicas para maximizar a qualidade da preparação de oócitos e geração de selo. Com todos os fatores otimizados, esta técnica dá uma probabilidade de geração de selo de sucesso mais de 90 por cento. O processo pode ser otimizado de forma diferente por cada pesquisador com base nos fatores que ele ou ela acha mais importante, e nós apresentamos a abordagem que levaram à maior sucesso em nossas mãos.
Protocol
Parte 1: Remover a membrana vitelina Prepare dois conjuntos de fórceps. Nós preferimos No. 5 fórceps, onde um conjunto foi ligeiramente afiada com uma lima. Também preparar uma pipeta de vidro por corte e polimento-fogo de 7 "Pasteur pipeta. Recomendações: Para evitar que os oócitos de escorregar, corte um círculo de grade (1 praças mm) e cola na parte inferior de uma placa de Petri 60mm. Este prato pode ser reutilizado indefinidamente se mantidos limpos entre os usos. <li…
Discussion
Há muitos parâmetros de gravação eletrofisiológico não serão discutidos aqui. Configuração de equipamento, sistema de gestão de ruído, expressão de canais e protocolos de gravação são também essenciais para bons resultados experimentais.
Em nossa experiência, estes são os parâmetros mais críticos para a formação de selos de confiança: oócitos de alta qualidade, a remoção da membrana vitelina rapidamente (aka, "peeling"), use pipetas recém puxado protegido de poeira, pipetas suave, a pressão posi…
Acknowledgements
Receita encolher solução é a partir do laboratório de RW Aldrich. Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).