Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.
Abstract
Depuis son développement en Sakmann et Neher 1, 2, le patch-clamp s'est imposé comme une technique extrêmement utile pour la mesure électrophysiologique des canaux ioniques uniques ou multiples dans les cellules. Cette technique peut être appliquée aux canaux ioniques, tant dans leur environnement natif et exprimé dans des cellules hétérologues, tels que des ovocytes récoltés à partir de la grenouille africaine griffes, Xenopus laevis. Ici, nous décrivons la technique bien établie de l'enregistrement de patch-clamp à partir d'ovocytes de Xénope. Cette technique est utilisée pour mesurer les propriétés des canaux ioniques exprimés soit au sein des populations (macropatch) ou individuellement (un seul canal d'enregistrement). Nous nous concentrons sur les techniques pour maximiser la qualité de la préparation des ovocytes et la génération de phoque. Avec tous les facteurs optimisée, cette technique donne une probabilité de succès au cours de génération d'étanchéité 90 pour cent. Le processus peut être optimisé différemment par chaque chercheur sur la base des facteurs qu'il ou elle trouve le plus important, et nous présentons la démarche qui ont conduit à la plus grande réussite dans nos mains.
Protocol
Partie 1: Retrait de la membrane vitelline Préparer deux séries de pinces. Nous préférons n ° 5 pinces, où un ensemble a été légèrement taillé avec un fichier. Préparez aussi une pipette de transfert en verre par parage et polissage au feu un 7 "pipette Pasteur. Recommandé: Pour prévenir les ovocytes de glisser, couper un cercle de grille (carrés de 1 mm) et de la colle dans le fond d'un plat de Pétri 60mm. Ce plat peut être réutilisé indéfiniment si maintenu pro…
Discussion
Il ya de nombreux paramètres d'enregistrement électrophysiologiques pas discuté ici. Configuration Rig, la gestion du bruit du système, l'expression de canaux, et des protocoles d'enregistrement sont tous également critique pour de bons résultats expérimentaux.
Dans notre expérience, ce sont les paramètres les plus critiques pour la formation de joints d'étanchéité fiable: ovocytes de grande qualité, en enlevant la membrane vitelline rapidement (aka, «peeling»), utiliser des pipettes nouvellement tiré…
Acknowledgements
Recette de solution de rétrécissement est du laboratoire de RW Aldrich. Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l'American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).