ويهدف هذا كمقدمة لتصحيح تسجيل المشبك من البويضات القيطم المورق. وهو يغطي إزالة الغشاء المحي ، وتشكيل ختم gigaohm (gigaseal) ، وتحويل اختياري من التصحيح إلى طوبولوجيا خارج التدريجي.
Abstract
منذ تطويره من قبل Sakmann وNeher 1 ، 2 ، أصبح المشبك التصحيح على النحو المنصوص عليه تقنية مفيدة للغاية لقياس كهربية من القنوات الأيونية واحدة أو متعددة في الخلايا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على القنوات الأيونية في بيئتها الأصلية على حد سواء ، وأعرب عن غيري في الخلايا ، مثل البويضات التي تحصد من الضفادع الأفريقية المخالب ، القيطم المورق. هنا ، نحن تصف تقنية راسخة من تسجيل المشبك التصحيح من البويضات القيطم. وتستخدم هذه التقنية لقياس خصائص القنوات الأيونية إما يتم التعبير عنها في السكان (macropatch) أو بشكل فردي (على قناة واحدة تسجيل). علينا أن نركز على تقنيات لتعظيم نوعية البويضة وإعداد جيل الختم. مع كل العوامل الأمثل ، وهذا الأسلوب يعطي احتمال توليد ختم ناجحة أكثر من 90 في المئة. قد يكون الأمثل في عملية مختلفة من قبل كل باحث على أساس عوامل يرى انه أو انها الأكثر أهمية ، ونحن نقدم النهج الذي قد يؤدي الى نجاح أكبر في أيدينا.
Protocol
الجزء 1 : إزالة الغشاء المحي إعداد مجموعتين من الملقط. نحن نفضل رقم 5 الملقط ، حيث تم ضبط واحد شحذ قليلا مع ملف. أيضا بإعداد ماصة نقل وقص الزجاج والنار تلميع – 7 "باستور ماصة. وأوصت : لمنع ا…
Discussion
هناك العديد من المعلمات تسجيل الكهربية لم تناقش هنا. تلاعب في الإعداد ، ونظام إدارة الضوضاء ، والتعبير القناة ، والبروتوكولات تسجيل كلها أمور حاسمة أيضا إلى نتائج تجريبية جيدة.
في تجربتنا ، هذه هي أهم معالم لتشكيل الأختام يعتمد عليها : البويضات ذات جود?…
Acknowledgements
تقلص وصفة الحل هو من مختبر الدريتش RW. نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Patch Clamp Amplifier & Software
Instrument
HEKA or Axon
EPC-10
Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)
Tool
Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution
Reagent
Ingredient In mM
N-methyl-D-glucamine 220
HEPES 10
MgCl2 1
EGTA 10
Aspartic Acid 220
KCl 2
pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
L Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936, doi:10.3791/936 (2008).