Модульная сборка на основе CRISPR для высокопроизводительного построения библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF
Summary
Представлен протокол модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass) — метода высокопроизводительного построения библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF у дрозофил с использованием общедоступных ресурсов кДНК/ORF. CRISPRmass может быть применен для редактирования различных библиотек плазмид.
Abstract
Функциональный геномный скрининг предлагает мощный подход к исследованию функции генов и опирается на создание полногеномных библиотек плазмид. Традиционные подходы к построению библиотек плазмид являются трудоемкими и трудоемкими. Поэтому недавно мы разработали простой и эффективный метод, модульную сборку на основе CRISPR (CRISPRmass), для высокопроизводительного конструирования всей геномной библиотеки плазмид, активирующей последовательность, комплементарную ДНК/открытую рамку считывания (UAS-cDNA/ORF). Здесь мы представляем протокол для CRISPRmass, взяв в качестве примера построение библиотеки плазмид UAS-cDNA/ORF на основе GAL4/UAS. Протокол включает в себя массово параллельные двухступенчатые реакции в пробирке с последующей бактериальной трансформацией. Первым шагом является линеаризация существующей комплементарной ДНК (кДНК) или открытой рамки считывания (ORF) кДНК или библиотечных плазмид ORF путем разрезания общих восходящих векторных последовательностей, прилегающих к 5′-концу кДНК или ORF, с использованием CRISPR/Cas9 вместе с одной направляющей РНК (sgRNA), а вторым шагом является вставка модуля UAS в линеаризованные кДНК или ORF плазмиды с использованием одноступенчатой реакции. CRISPRmass позволяет просто, быстро, эффективно и экономично конструировать различные библиотеки плазмид. Библиотека плазмид UAS-кДНК/ORF может быть использована для скрининга усиления функции в культивируемых клетках и для создания полногеномной трансгенной библиотеки UAS-кДНК/ORF у дрозофил.
Introduction
Непредвзятый полногеномный генетический скрининг является мощным подходом к идентификации генов, участвующих в данном биологическом процессе, и выяснению его механизма. Поэтому он широко используется в различных областях биологических исследований. Примерно 60% генов дрозофилы консервативны у человека 1,2, а ~75% генов болезней человека имеют гомологи у дрозофилы3. Генетический скрининг в основном делится на два типа: потеря функции (LOF) и приобретение функции (GOF). Генетический скрининг LOF у дрозофил сыграл решающую роль в выяснении механизмов, которые управляют почти каждым аспектом биологии. Тем не менее, большинство генов дрозофилы не имеют явного фенотипа LOF4, и поэтому скрининг GOF является важным методом изучения функции этих генов 4,5.
Бинарная система GAL4/UAS обычно используется для тканевой специфической экспрессии генов у дрозофилы 6. В этой системе ткань специфически экспрессирует активатор транскрипции дрожжей GAL4, который связывается с чувствительным к GAL4 элементом (UAS) и тем самым активирует транскрипцию нижестоящих генетических компонентов (например, кДНК и ORF)6. Для проведения полногеномного скрининга GOF у дрозофил нам необходимо создать полногеномную библиотеку плазмид UAS-кДНК/ORF и, впоследствии, трансгенную библиотеку UAS-кДНК/ORF у дрозофилы.
Создание полногеномной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF традиционными методами из общедоступных клонов кДНК/ORF является трудоемким и трудоемким процессом, так как каждый ген требует индивидуального дизайна, включая дизайн и синтез праймеров, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и очистку геля, секвенирование, рестрикционное расщепление и т.д. 7,8. Таким образом, построение такой плазмидной библиотеки является ограничивающим шагом в создании полногеномной трансгенной библиотеки UAS-cDNA/ORF у дрозофилы. Недавно мы успешно решили эту проблему, разработав новый метод модульной сборки на основе CRISPR (CRISPRmass)9. Суть CRISPRmass заключается в манипулировании общими векторными последовательностями библиотеки плазмид с помощью комбинации технологии редактирования генов и технологии бесшовного клонирования.
Здесь мы представляем протокол для CRISPRmass, который включает в себя массивно параллельные двухступенчатые реакции в пробирке с последующей бактериальной трансформацией. CRISPRmass — это простой, быстрый, эффективный и экономичный метод, который, в принципе, может быть использован для высокопроизводительного конструирования различных плазмидных библиотек.
Стратегия CRISPRmass
Процедура CRISPRmass начинается с параллельных двухступенчатых реакций в пробирке до превращения Escherichia coli (E. coli) (рис. 1). Шаг 1 заключается в расщеплении идентичных векторных остов кДНК/ORF плазмид Cas9/sgRNA. Идеальный сайт расщепления примыкает к 5′-концу кДНК/ЧОР. Продукты расщепления не нуждаются в очистке. На этапе 2 происходит вставка вектор-специфичного модуля UAS в линеаризованные кДНК/ORF плазмиды Cas9/sgRNA путем сборки Gibson (далее – одноступенчатая реакция), в результате чего образуются UAS-кДНК/ORF плазмиды. 5′- и 3′-концевые последовательности модуля UAS перекрываются с последовательностями линеаризованных плазмид кДНК/ORF, что позволяет проводить одноступенчатую реакцию.
Одноступенчатые продукты реакции непосредственно подвергаются превращению E. coli . Теоретически только желаемые колонии UAS-кДНК/ORF могут расти на пластинах Лурии-Бертани (LB), которые содержат селекционные антибиотики, соответствующие гену устойчивости к антибиотикам модуля UAS. Модуль UAS состоит из ядра модуля UAS, гена устойчивости к антибиотикам, отличного от гена кДНК или плазмид ORF, а также 5′- и 3′-концевых последовательностей. Основной модуль UAS включает в себя 10 копий UAS, минимальный промотор Hsp70, последовательность attB для геномной интеграции, опосредованной phiC31, и маркер трансформации мини-белого для Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важными этапами CRISPRmass являются дизайн sgRNA и оценка sgRNAs. Выбор высокоэффективных sgРНК для Cas9 является ключом к успеху CRISPRmass. Если после трансформации E. coli с одноступенчатыми продуктами сборки реакции на большинстве антибиотиксодержащих LB-планшетов наблюдается очень мало коло?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была спонсирована Национальным фондом естественных наук Китая (32071135 и 31471010), Шанхайской программой Пуцзян (14PJ1405900) и Фондом естественных наук Шанхая (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
