تجميع معياري قائم على كريسبر لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF
Summary
نقدم بروتوكولا للتجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، وهي طريقة لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF في ذبابة الفاكهة باستخدام موارد cDNA / ORF المتاحة للجمهور. يمكن تطبيق CRISPRmass لتحرير مكتبات البلازميد المختلفة.
Abstract
يوفر فحص الجينوم الوظيفي نهجا قويا لفحص وظيفة الجينات ويعتمد على بناء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم. الأساليب التقليدية لبناء مكتبة البلازميد تستغرق وقتا طويلا وشاقة. لذلك ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة بسيطة وفعالة ، التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) ، لبناء عالي الإنتاجية لمكتبة البلازميد على مستوى الجينوم على مستوى المنبع لتنشيط تسلسل الحمض النووي / إطار القراءة المفتوحة (UAS-cDNA / ORF). هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRmass ، مع الأخذ على سبيل المثال إنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF قائمة على GAL4 / UAS. يتضمن البروتوكول تفاعلات أنبوب اختبار متوازية على نطاق واسع من خطوتين يتبعها تحول بكتيري. تتمثل الخطوة الأولى في خطي الحمض النووي التكميلي الحالي (cDNA) أو إطار القراءة المفتوح (ORF) cDNA أو بلازميدات مكتبة ORF عن طريق قطع تسلسلات متجهات المنبع المشتركة المجاورة لنهاية 5 ‘من cDNAs أو ORFs باستخدام CRISPR / Cas9 جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) ، والخطوة الثانية هي إدخال وحدة UAS في بلازميدات cDNA أو ORF الخطية باستخدام تفاعل خطوة واحدة. يسمح CRISPRmass ببناء بسيط وسريع وفعال وفعال من حيث التكلفة لمكتبات البلازميد المختلفة. يمكن استخدام مكتبة البلازميد UAS-cDNA / ORF لفحص اكتساب الوظيفة في الخلايا المستزرعة ولبناء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة.
Introduction
يعد الفحص الجيني الكامل غير المتحيز نهجا قويا لتحديد الجينات المشاركة في عملية بيولوجية معينة وتوضيح آليتها. لذلك ، يستخدم على نطاق واسع في مختلف مجالات البحوث البيولوجية. يتم حفظ ما يقرب من 60 ٪ من جينات ذبابة الفاكهة في البشر1،2 ، و ~ 75 ٪ من جينات الأمراض البشرية لها متجانسات في ذبابة الفاكهة3. ينقسم الفحص الجيني بشكل أساسي إلى نوعين: فقدان الوظيفة (LOF) واكتساب الوظيفة (GOF). لعبت الفحوصات الجينية LOF في ذبابة الفاكهة دورا حاسما في توضيح الآليات التي تحكم كل جانب من جوانب علم الأحياء تقريبا. ومع ذلك ، فإن غالبية جينات ذبابة الفاكهة لا تحتوي على أنماط ظاهرية واضحة ل LOF4 ، وبالتالي ، فإن فحص GOF هو طريقة مهمة لدراسة وظيفة تلك الجينات 4,5.
يستخدم نظام GAL4 / UAS الثنائي بشكل شائع للتعبير الجيني الخاص بالأنسجة في ذبابة الفاكهة6. في هذا النظام ، يعبر النسيج على وجه التحديد عن منشط نسخ الخميرة GAL4 الذي يرتبط بالعنصر المستجيب GAL4 (UAS) وبالتالي ينشط نسخ المكونات الجينية النهائية (على سبيل المثال ، cDNA و ORF) 6. لإجراء شاشات GOF على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة ، نحتاج إلى إنشاء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم ، وبالتالي مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا في ذبابة الفاكهة.
إن بناء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF على مستوى الجينوم بالطرق التقليدية من استنساخ cDNA / ORF المتاحة للجمهور يستغرق وقتا طويلا وشاقا ، حيث يتطلب كل جين تصميمات فردية ، بما في ذلك تصميم التمهيدي والتوليف ، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، وتنقية الهلام ، والتسلسل ، وتقييد الهضم ، وما إلى ذلك 7,8. لذلك ، فإن بناء مكتبة البلازميد هذه هو خطوة تحد من المعدل في إنشاء مكتبة UAS-cDNA / ORF المعدلة وراثيا على مستوى الجينوم في ذبابة الفاكهة. في الآونة الأخيرة ، نجحنا في حل هذه المشكلة من خلال تطوير طريقة جديدة ، التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass) 9. يتمثل جوهر CRISPRmass في معالجة تسلسل المتجهات المشتركة لمكتبة البلازميد من خلال مزيج من تقنية تحرير الجينات وتقنية الاستنساخ السلس.
هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRmass ، والذي يتضمن تفاعلات أنبوب اختبار متوازية بشكل كبير من خطوتين متبوعة بالتحول البكتيري. CRISPRmass هي طريقة بسيطة وسريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ، والتي ، من حيث المبدأ ، يمكن استخدامها لبناء عالي الإنتاجية لمكتبات البلازميد المختلفة.
استراتيجية كريسبر ماس
يبدأ إجراء CRISPRmass بتفاعلات أنبوب اختبار متوازية من خطوتين قبل تحول الإشريكية القولونية (E. coli) (الشكل 1). الخطوة 1 هي انشقاق العمود الفقري المتجه المطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 / sgRNA. موقع الانقسام المثالي مجاور لنهاية 5 من cDNA / ORF. لا يلزم تنقية منتجات الانقسام. الخطوة 2 هي إدخال وحدة UAS خاصة بالمتجهات في بلازميدات cDNA / ORF الخطية Cas9 / sgRNA بواسطة تجميع جيبسون (يشار إليها فيما يلي باسم تفاعل الخطوة الواحدة) ، مما ينتج عنه بلازميدات UAS-cDNA / ORF. تتداخل التسلسلات الطرفية 5 و 3 لوحدة UAS مع تلك الخاصة ببلازميدات cDNA / ORF الخطية ، مما يتيح تفاعل الخطوة الواحدة.
تخضع منتجات التفاعل أحادية الخطوة مباشرة لتحول الإشريكية القولونية . من الناحية النظرية ، يمكن فقط لمستعمرات UAS-cDNA / ORF المرغوبة أن تنمو على ألواح Luria-Bertani (LB) التي تحتوي على مضادات حيوية مختارة تتوافق مع جين مقاومة المضادات الحيوية لوحدة UAS. تتكون وحدة UAS من وحدة UAS الأساسية ، وجين مقاوم للمضادات الحيوية يختلف عن بلازميدات cDNA أو ORF ، والتسلسلات الطرفية 5 و 3. تتكون وحدة UAS الأساسية من 10 نسخ من UAS ، ومروج الحد الأدنى Hsp70 ، وتسلسل attB للتكامل الجيني بوساطة phiC31 ، وعلامة تحويل بيضاء مصغرة لذبابة الفاكهة7.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم خطوات كريسبر ماس هي تصميم sgRNAs وتقييم sgRNAs. يعد اختيار sgRNAs عالية الكفاءة ل Cas9 أمرا أساسيا لنجاح CRISPRmass. إذا لوحظت مستعمرات قليلة جدا أو معدومة على غالبية ألواح LB المحتوية على المضادات الحيوية بعد تحول الإشريكية القولونية مع منتجات تجميع التفاعل أحادية الخطوة ، تحقق من هضم البلازميد عن طر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم رعاية هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32071135 و 31471010) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
