הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.
Abstract
בדיקת גנומיקה פונקציונלית מציעה גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים ומסתמכת על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. לכן, פיתחנו לאחרונה שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), לבניית תפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד במעלה הזרם המפעילה רצף דנ”א משלים/מסגרת קריאה פתוחה (UAS-cDNA/ORF). כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, תוך לקיחת כדוגמה את הבנייה של ספריית פלסמיד מבוססת GAL4/UAS UAS-cDNA/ORF. הפרוטוקול כולל תגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי ולאחריהן טרנספורמציה חיידקית. השלב הראשון הוא לינאריות של פלסמידים קיימים של DNA משלים (cDNA) או מסגרת קריאה פתוחה (ORF) cDNA או ספריית ORF על ידי חיתוך הרצפים הווקטוריים המשותפים במעלה הזרם הסמוכים לקצה 5′ של cDNA או ORFs באמצעות CRISPR/Cas9 יחד עם RNA מנחה יחיד (sgRNA), והשלב השני הוא החדרת מודול UAS לתוך פלסמידים cDNA ליניארי או ORF באמצעות תגובה חד שלבית. CRISPRmass מאפשר בנייה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית של ספריות פלסמיד שונות. ספריית הפלסמיד UAS-cDNA/ORF יכולה לשמש לבדיקת רווח תפקוד בתאים בתרבית ולבניית ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה.
Introduction
סריקה גנטית בלתי משוחדת של גנום שלם היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים המעורבים בתהליך ביולוגי נתון ולהבהרת המנגנון שלו. לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. כ-60% מהגנים של דרוזופילה נשמרים בבני אדם 1,2, ו~75% מהגנים של מחלות אנושיות מכילים הומולוגים בדרוזופילה3. בדיקות סקר גנטיות נחלקות בעיקר לשני סוגים: אובדן תפקוד (LOF) ושיפור תפקוד (GOF). המסכים הגנטיים של LOF בדרוזופילה מילאו תפקיד קריטי בהבהרת מנגנונים השולטים כמעט בכל היבט של הביולוגיה. עם זאת, לרוב הגנים של דרוזופילה אין פנוטיפים ברורים של LOF4, ולכן, בדיקת GOF היא שיטה חשובה לחקר תפקודם של גנים אלה 4,5.
המערכת הבינארית GAL4/UAS משמשת בדרך כלל לביטוי גנים ספציפיים לרקמות בדרוזופילה6. במערכת זו, הרקמה מבטאת באופן ספציפי מפעיל שעתוק שמרים GAL4 הנקשר לאלמנט המגיב GAL4 (UAS) ובכך מפעיל שעתוק של המרכיבים הגנטיים במורד הזרם (למשל, cDNA ו- ORF)6. כדי לבצע מסכי GOF רחבי גנום בדרוזופילה, עלינו לבנות ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום, ולאחר מכן ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה.
בניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF רחבת גנום בשיטות קונבנציונליות משיבוטים cDNA/ORF הזמינים לציבור היא גוזלת זמן ומייגעת, מכיוון שכל גן דורש עיצובים אינדיבידואליים, כולל תכנון וסינתזה ראשוניים, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טיהור ג’ל, ריצוף, הגבלת עיכול וכן הלאה 7,8. לכן, בניית ספריית פלסמיד כזו היא צעד מגביל קצב ביצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה. לאחרונה, פתרנו בהצלחה בעיה זו על ידי פיתוח שיטה חדשנית, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass)9. הליבה של CRISPRmass היא לתפעל את הרצפים הווקטוריים המשותפים של ספריית פלסמיד באמצעות שילוב של טכנולוגיית עריכת גנים וטכנולוגיית שיבוט חלקה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, הכולל תגובות מבחנה מקבילות מאסיביות בשני שלבים ואחריו טרנספורמציה חיידקית. CRISPRmass היא שיטה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית, שבאופן עקרוני ניתן להשתמש בה לבניית תפוקה גבוהה של ספריות פלסמיד שונות.
אסטרטגיית CRISPRmass
ההליך של CRISPRmass מתחיל בתגובות מבחנה מקבילות בשני שלבים לפני טרנספורמציית Escherichia coli (E. coli) (איור 1). שלב 1 הוא הפיצול של עמוד השדרה הווקטורי הזהה של פלסמידים cDNA/ORF על ידי Cas9/sgRNA. אתר מחשוף אידיאלי צמוד לקצה 5′ של cDNA/ORF. מוצרי המחשוף אינם חייבים להיות מטוהרים. שלב 2 הוא החדרת מודול כטב”ם ספציפי לווקטור לתוך פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים Cas9/sgRNA על ידי הרכבת גיבסון (להלן תגובה חד-שלבית), וכתוצאה מכך פלסמידים של UAS-cDNA/ORF. רצפי הטרמינלים 5′ ו-3′ של מודול כטב”ם חופפים לאלה של פלסמידים cDNA/ORF ליניאריים, ומאפשרים תגובה חד-שלבית.
תוצרי התגובה החד-שלבית נתונים ישירות לטרנספורמציה של E. coli . תיאורטית, רק מושבות UAS-cDNA/ORF הרצויות יכולות לגדול על לוחות לוריא-ברטאני (LB) המכילים אנטיביוטיקה ברירה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה של מודול הכטב”ם. מודול הכטב”ם מורכב ממודול ליבה של כטב”מים, גן עמידות לאנטיביוטיקה הנבדל מזה של פלסמידים cDNA או ORF, ורצפים טרמינליים 5′ ו-3′. מודול ליבה של כטב”ם כולל 10 עותקים של כטב”ם, מקדם מינימלי Hsp70, רצף attB לאינטגרציה גנומית בתיווך phiC31, וסמן טרנספורמציה מיני לבן עבור דרוזופילה7.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר של CRISPRmass הם תכנון של sgRNA והערכה של sgRNAs. בחירה של sgRNA יעיל במיוחד עבור Cas9 היא המפתח להצלחה של CRISPRmass. אם מעט מאוד מושבות או בכלל לא נצפות על רוב לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה לאחר השינוי של E. coli עם מוצרי הרכבה תגובה בצעד אחד, לבדוק עיכול פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג’ל agarose. אם פ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071135 ו 31471010), תוכנית שנגחאי פוג’יאנג (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנחאי (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
