Assemblage modulaire basé sur CRISPR pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF
Summary
Nous présentons un protocole d’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass), une méthode pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-ADNc/ORF chez la drosophile en utilisant des ressources d’ADNc/ORF accessibles au public. CRISPRmass peut être appliqué à l’édition de diverses banques de plasmides.
Abstract
Le criblage en génomique fonctionnelle offre une approche puissante pour sonder la fonction des gènes et repose sur la construction de bibliothèques de plasmides à l’échelle du génome. Les approches conventionnelles pour la construction de bibliothèques de plasmides prennent du temps et sont laborieuses. Par conséquent, nous avons récemment développé une méthode simple et efficace, l’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass), pour la construction à haut débit d’une bibliothèque de plasmides UAS-cDNA/ORF (séquence d’activation en amont à l’échelle du génome). Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRmass, en prenant comme exemple la construction d’une bibliothèque de plasmides UAS-ADNc/ORF basée sur GAL4/UAS. Le protocole comprend des réactions massivement parallèles en deux étapes en éprouvette, suivies d’une transformation bactérienne. La première étape consiste à linéariser les plasmides d’ADN cDNA ou de banque ORF (ADNc) complémentaire (ADNc) ou ORF existants en coupant les séquences vectorielles partagées en amont adjacentes à l’extrémité 5′ des ADNc ou des ORF à l’aide de CRISPR/Cas9 avec un ARN guide unique (sgRNA), et la deuxième étape consiste à insérer un module UAS dans les plasmides d’ADNc ou ORF linéarisés en utilisant une réaction en une seule étape. CRISPRmass permet la construction simple, rapide, efficace et rentable de diverses banques de plasmides. La banque de plasmides UAS-cDNA/ORF peut être utilisée pour le criblage du gain de fonction dans les cellules en culture et pour la construction d’une banque transgénique UAS-cDNA/ORF à l’échelle du génome chez la drosophile.
Introduction
Le dépistage génétique impartial du génome entier est une approche puissante pour identifier les gènes impliqués dans un processus biologique donné et élucider son mécanisme. Par conséquent, il est largement utilisé dans divers domaines de la recherche biologique. Environ 60% des gènes de la drosophile sont conservés chez l’homme 1,2, et ~75% des gènes de la maladie humaine ont des homologues chez la drosophile3. Le dépistage génétique est principalement divisé en deux types : la perte de fonction (LOF) et le gain de fonction (GOF). Les criblages génétiques LOF chez la drosophile ont joué un rôle essentiel dans l’élucidation des mécanismes qui régissent presque tous les aspects de la biologie. Cependant, la majorité des gènes de la drosophile n’ont pas de phénotypes LOF4 évidents, et par conséquent, le dépistage GOF est une méthode importante pour étudier la fonction de ces gènes 4,5.
Le système binaire GAL4/UAS est couramment utilisé pour l’expression génique spécifique des tissus chez la drosophile6. Dans ce système, le tissu exprime spécifiquement l’activateur de transcription de la levure GAL4 qui se lie à l’élément sensible à GAL4 (UAS) et active ainsi la transcription des composants génétiques en aval (par exemple, l’ADNc et l’ORF)6. Pour effectuer des criblages GOF à l’échelle du génome chez la drosophile, nous devons construire une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome et, par la suite, une banque transgénique UAS-ADNc/ORF chez la drosophile.
La construction d’une banque de plasmides UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome par des méthodes conventionnelles à partir de clones d’ADNc/ORF accessibles au public prend du temps et est laborieuse, car chaque gène nécessite des conceptions individualisées, y compris la conception et la synthèse d’amorces, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la purification du gel, le séquençage, la digestion par restriction, etc. 7,8. Par conséquent, la construction d’une telle banque de plasmides est une étape limitant le débit dans la création d’une banque transgénique UAS-ADNc/ORF à l’échelle du génome chez la drosophile. Récemment, nous avons réussi à résoudre ce problème en développant une nouvelle méthode, l’assemblage modulaire basé sur CRISPR (CRISPRmass)9. L’essentiel de CRISPRmass consiste à manipuler les séquences de vecteurs partagés d’une bibliothèque de plasmides grâce à une combinaison de technologie d’édition de gènes et de technologie de clonage sans couture.
Ici, nous présentons un protocole pour CRISPRmass, qui comprend des réactions massivement parallèles en tube à essai en deux étapes suivies d’une transformation bactérienne. CRISPRmass est une méthode simple, rapide, efficace et rentable qui, en principe, peut être utilisée pour la construction à haut débit de diverses banques de plasmides.
Stratégie CRISPRmass
La procédure de CRISPRmass commence par des réactions parallèles en tube à essai en deux étapes avant la transformation d’Escherichia coli (E. coli) (Figure 1). L’étape 1 est le clivage des squelettes vectoriels identiques des plasmides ADNc/ORF par Cas9/sgRNA. Un site de clivage idéal est adjacent à l’extrémité 5′ de l’ADNc/ORF. Les produits de décolleté n’ont pas besoin d’être purifiés. L’étape 2 consiste à insérer un module UAS spécifique du vecteur dans les plasmides ADNc/ORF linéarisés Cas9/sgRNA par assemblage de Gibson (ci-après appelé réaction en une seule étape), ce qui permet d’obtenir des plasmides UAS-ADNc/ORF. Les séquences terminales 5′ et 3′ d’un module UAS se chevauchent avec celles des plasmides linéarisés ADNc/ORF, permettant la réaction en une seule étape.
Les produits de réaction en une seule étape sont directement soumis à la transformation d’E. coli . Théoriquement, seules les colonies UAS-ADNc/ORF souhaitées peuvent se développer sur des plaques Luria-Bertani (LB) qui contiennent des antibiotiques sélectionnés correspondant au gène de résistance aux antibiotiques du module UAS. Le module UAS est composé d’un module UAS central, d’un gène de résistance aux antibiotiques distinct de celui des plasmides d’ADNc ou d’ORF, et des séquences terminales 5′ et 3′. Un module UAS de base comprend 10 copies d’UAS, un promoteur minimal Hsp70, une séquence attB pour l’intégration génomique médiée par phiC31 et un marqueur de transformation mini-blanc pour la drosophile7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques de CRISPRmass sont la conception des ARNsg et l’évaluation des ARNsg. La sélection d’ARNsg hautement efficaces pour Cas9 est la clé du succès de CRISPRmass. Si très peu ou pas de colonies sont observées sur la majorité des plaques LB contenant des antibiotiques après la transformation d’E. coli avec des produits d’assemblage de réaction en une seule étape, vérifier la digestion du plasmide par électrophorèse sur gel d’agarose. Si les plasmides ne sont pas bien digér?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été parrainé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32071135 et 31471010), le programme Pujiang de Shanghai (14PJ1405900) et la Fondation des sciences naturelles de Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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