UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly
Summary
공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 리소스를 사용하여 Drosophila 에서 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축 방법인 CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)를 위한 프로토콜을 제시합니다. CRISPRmass는 다양한 플라스미드 라이브러리 편집에 적용할 수 있습니다.
Abstract
기능적 유전체학 스크리닝은 유전자 기능을 프로브하기 위한 강력한 접근법을 제공하며 게놈 전반의 플라스미드 라이브러리 구축에 의존합니다. plasmid library 구축을 위한 기존의 접근법은 시간과 노력이 많이 듭니다. 따라서 최근에는 유전체 전체 업스트림 활성화 서열 보완 DNA/개방형 판독 프레임(UAS-cDNA/ORF) 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축을 위한 간단하고 효율적인 방법인 CRISPR-based modular assembly(CRISPRmass)를 개발했습니다. 여기에서는 GAL4/UAS 기반 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 구축을 예로 들어 CRISPRmass를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 대규모로 병렬화된 2단계 시험관 반응과 박테리아 변형이 포함됩니다. 첫 번째 단계는 CRISPR/Cas9와 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 함께 사용하여 cDNA 또는 ORF의 5′ 말단에 인접한 공유 업스트림 벡터 염기서열을 절단하여 기존 상보적 DNA(cDNA) 또는 개방형 판독 프레임(ORF) cDNA 또는 ORF 라이브러리 플라스미드를 선형화하는 것이며, 두 번째 단계는 단일 단계 반응을 사용하여 선형화된 cDNA 또는 ORF 플라스미드에 UAS 모듈을 삽입하는 것입니다. CRISPRmass를 사용하면 다양한 플라스미드 라이브러리를 간단하고 빠르며 효율적이며 비용 효율적으로 구축할 수 있습니다. UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리는 배양된 세포의 Gain-of-Function 스크리닝 및 초파리에서 게놈 전반의 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 구축하는 데 활용할 수 있습니다.
Introduction
편향되지 않은 전체 게놈 유전자 스크리닝은 주어진 생물학적 과정에 관여하는 유전자를 식별하고 그 메커니즘을 규명하기 위한 강력한 접근 방식입니다. 따라서 생물학 연구의 다양한 분야에서 널리 사용됩니다. 초파리 유전자의 약 60%는 인간 1,2에서 보존되며, 인간 질병 유전자의 ~75%는 초파리3에서 상동체를 가지고 있습니다. 유전자 검사는 크게 LOF(loss of function)와 GOF(gain of function)의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 초파리의 LOF 유전자 스크리닝은 생물학의 거의 모든 측면을 지배하는 메커니즘을 규명하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 대부분의 초파리 유전자는 명백한 LOF 표현형4을 가지고 있지 않으므로 GOF 스크리닝은 이러한 유전자 4,5의 기능을 연구하는 중요한 방법입니다.
binary GAL4/UAS 시스템은 Drosophila6에서 조직 특이적 유전자 발현에 일반적으로 사용됩니다. 이 시스템에서 조직은 GAL4 반응 요소(UAS)에 결합하는 효모 전사 활성인자 GAL4를 특이적으로 발현하여 다운스트림 유전 성분(예: cDNA 및 ORF)의 전사를 활성화합니다6. 초파리에서 게놈 전반의 GOF 스크리닝을 수행하기 위해서는 게놈 전반의 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 구축해야 하며, 이어서 초파리에서 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 구축해야 합니다.
공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 클론에서 기존 방법으로 게놈 전체 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 구축하는 것은 모든 유전자가 프라이머 설계 및 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 겔 정제, 염기서열 분석, 제한 소화 등을 포함한 개별화된 설계를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 힘들다7,8. 따라서, 이러한 플라스미드 라이브러리의 구축은 초파리에서 게놈 전반의 형질전환 UAS-cDNA/ORF 라이브러리를 생성하는 속도 제한 단계입니다. 최근에는 새로운 방법인 CRISPRmass(CRISPR-based modular assembly)9를 개발하여 이 문제를 성공적으로 해결했습니다. CRISPRmass의 핵심은 유전자 편집 기술과 Seamless cloning 기술의 조합을 통해 플라스미드 라이브러리의 공유 벡터 염기서열을 조작하는 것입니다.
여기에서는 CRISPRmass에 대한 프로토콜을 제시하며, 여기에는 대규모 병렬 2단계 시험관 반응 후 박테리아 변형이 포함됩니다. CRISPRmass는 원칙적으로 다양한 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축에 사용할 수 있는 간단하고 빠르며 효율적이며 비용 효율적인 방법입니다.
CRISPRmass 전략
CRISPRmass의 절차는 대장 균(E. coli) 형질전환에 앞서 병렬 2단계 시험관 반응으로 시작됩니다(그림 1). 1단계는 Cas9/sgRNA에 의한 cDNA/ORF 플라스미드의 동일한 벡터 백본을 절단하는 것입니다. 이상적인 절단 부위는 cDNA/ORF의 5′ 말단에 인접해 있습니다. 분열 산물은 정제할 필요가 없습니다. 2단계는 Gibson 어셈블리(이하 single step reaction)에 의해 Cas9/sgRNA 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드에 벡터 특이적 UAS 모듈을 삽입하여 UAS-cDNA/ORF 플라스미드를 생성하는 것입니다. UAS 모듈의 5′ 및 3′ 말단 염기서열은 선형화된 cDNA/ORF 플라스미드의 염기서열과 겹치므로 단일 단계 반응이 가능합니다.
단일 단계 반응 산물은 직접 E. coli 변형을 거칩니다. 이론적으로, UAS 모듈의 항생제 내성 유전자에 해당하는 선택 항생제를 포함하는 Luria-Bertani(LB) 플레이트에서는 원하는 UAS-cDNA/ORF 콜로니만 성장할 수 있습니다. UAS 모듈은 핵심 UAS 모듈, cDNA 또는 ORF 플라스미드와 구별되는 항생제 내성 유전자, 5′ 및 3′ 말단 서열로 구성됩니다. 핵심 UAS 모듈은 UAS 사본 10개, Hsp70 최소 프로모터, phiC31 매개 게놈 통합을 위한 attB 염기서열, Drosophila7에 대한 mini-white 형질전환 마커로 구성됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPRmass의 가장 중요한 단계는 sgRNA의 설계와 sgRNA의 평가입니다. Cas9에 대한 고효율 sgRNA의 선택은 CRISPRmass 성공의 핵심입니다. 단단계 반응 조립 산물로 E. coli를 형질전환시킨 후 대부분의 항생제 함유 LB 플레이트에서 콜로니가 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않는 경우, 아가로스 겔 전기영동에 의한 플라스미드 분해를 확인합니다. 플라스미드가 잘 소화되지 않으면 Cas9 활성, sgRNA 분해 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 32071135 및 31471010), 상하이 푸장 프로그램(Shanghai Pujiang Program, 14PJ1405900), 상하이 자연과학재단(Natural Science Foundation of Shanghai, 19ZR1446400)의 후원을 받았다.
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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