Summary

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Abstract

Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT’ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.

Introduction

Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF’si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC’ler) dahil olmak üzere birkaç beklenen hücre popülasyonundan oluşur5,6. Yağ dokusunun SVF’sinde bulunan ASPC’lerin olgun adipositlere yol açabileceği iyi bilinmektedir5. SVF’nin PVAT’ta kritik bir olgun adiposit kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Birkaç çalışma, PVAT-SVF’nin belirli indüksiyon koşulları altında olgun adipositlere farklılaşabileceğini göstermiştir 6,7,8.

Şu anda, SVF’yi yağ dokusundan izole etmek için biri enzimatik sindirim ve diğeri enzimatik olmayan olmak üzere iki izolasyon sistemi vardır9. Enzimatik yöntemler tipik olarak daha yüksek çekirdekli progenitör hücre verimi ile sonuçlanır10. Bugüne kadar, SVF’nin yara iyileşmesi, ürogenital ve kardiyovasküler hastalıklarda vasküler rejenerasyonu ve neovaskülarizasyonu desteklemedeki faydaları, özellikle dermatoloji ve plastik cerrahide12,13 yaygın olarak gösterilmiştir11. Bununla birlikte, PVAT’tan türetilen SVF’nin klinik uygulama beklentileri iyi araştırılmamıştır, bu da SVF’nin PVAT’tan izolasyonu için standart bir yöntemin olmamasına bağlanabilir. Bu protokolün amacı, torasik aortu çevreleyen fare PVAT’ından SVF’den türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmak ve PVAT fonksiyonunun daha fazla araştırılmasını sağlamaktır. Bu protokol, genç farelerden elde edilen periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşma tekniklerini optimize eder.

Protocol

Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi’ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir. 1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 …

Representative Results

Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT’leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT’lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C’de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (<strong class="xfig…

Discussion

Fare periaortik yağ dokusundan SVF’den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF’nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi’nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.2 μm syringe filters PALL 4612
12-well plate  Labselect 11210
15 mL centrifuge tube Labserv 310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T-2877 1 nM
50 mL centrifuge tube Labselect CT-002-50A
anti-adiponectin Abcam ab22554 1:1,000 working concentration
anti-COX IV CST 4850 1:1,000 working concentration
anti-FABP4 CST 2120 1:1,000 working concentration
anti-PGC1α Abcam ab191838 1:1,000 working concentration
anti-PPARγ Invitrogen MA5-14889 1:1,000 working concentration
anti-UCP1 Abcam ab10983 1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin CST 6487 1:1,000 working concentration
BSA Beyotime ST023-200g 1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon Falcon 352350
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich C8919
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196 1 mg/mL
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756 1 μM
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G 4 mg/mL
Fetal bovine serum  Gibco 16000-044 10%
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G 20 mM
High glucose DMEM Hyclone SH30022.01
IBMX  Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM
Incubator with orbital shaker Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. LYZ-103B
Insulin (cattle)  Sigma-Aldrich 11070-73-8 1 μM
Isoflurane RWD R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution Pricella  PB180347 protect from light 
Microsurgical forceps Beyotime FS233
Microsurgical scissor Beyotime FS217
Oil Red O  Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd B548117-0500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  115-035-146 1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-035-144 1:5,000 working concentration
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM
Standard forceps Beyotime FS225
Surgical scissor Beyotime FS001

References

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
  3. Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
  4. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  5. Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
  6. Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
  7. Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  8. Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
  9. Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
  10. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
  11. Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
  12. Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
  13. Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
  14. Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
  15. Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
  16. Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
  17. Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
  18. Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
  19. Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
  20. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  21. Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
  22. Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
  23. Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
  24. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  25. Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
  26. Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
  27. Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
  28. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  29. Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
  30. Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).

Play Video

Cite This Article
Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, Y., Cai, Z., He, B. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (197), e65703, doi:10.3791/65703 (2023).

View Video