Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Abstract

Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist ein Fettgewebsdepot, das Blutgefäße umgibt und die Phänotypen weißer, beigefarbener und brauner Adipozyten aufweist. Neuere Entdeckungen haben die zentrale Rolle von PVAT bei der Regulierung der vaskulären Homöostase und der Beteiligung an der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beleuchtet. Ein umfassendes Verständnis der Eigenschaften und Regulation von PVAT ist von großer Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Therapien. Primärkulturen von periaortalen Adipozyten sind wertvoll für die Untersuchung der PVAT-Funktion und der Interaktion zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen. In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und praktikables Protokoll für die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus vorgestellt, das für die Modellierung der Adipogenese oder Lipogenese in vitro nützlich sein kann. Das Protokoll beschreibt die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten aus jungen Mäusen. Dieses Protokoll wird den technologischen Grundstein für die Untersuchung der PVAT-Funktion auf der Laborseite bilden.

Introduction

Es wird angenommen, dass perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), eine perivaskuläre Struktur, die aus einer Mischung aus reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) besteht, über sein Sekretom parakrin mit der angrenzenden Gefäßwand interagiert¹. Als kritischer Regulator der vaskulären Homöostase ist die PVAT-Dysfunktion an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt ^2,3,4. Die SVF des Adipozytengewebes besteht aus mehreren erwarteten Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, Immunzellen, Mesothelzellen, neuronale Zellen sowie Fettstamm- und Vorläuferzellen (ASPCs)^5,6. Es ist bekannt, dass ASPCs, die sich in der SVF des Fettgewebes befinden, reife Adipozyten hervorbringen können⁵. Es wird angenommen, dass SVF eine kritische Quelle für reife Adipozyten in PVAT ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PVAT-SVF unter bestimmten Induktionsbedingungen in reife Adipozyten differenzieren kann ^6,7,8.

Derzeit gibt es zwei Isolationssysteme zur Isolierung von SVF aus Fettgewebe, eines ist die enzymatische Verdauung und das andere ist nicht-enzymatisch⁹. Enzymatische Methoden führen typischerweise zu einer höheren Ausbeute an kernhaltigen Vorläuferzellen¹⁰. Bis heute wurden die Vorteile von SVF bei der Förderung der Gefäßregeneration und Neovaskularisation bei Wundheilungs-, Urogenital- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen umfassend nachgewiesen¹¹, insbesondere in der Dermatologie und plastischen Chirurgie^12,13. Die klinischen Anwendungsaussichten von PVAT-abgeleitetem SVF sind jedoch noch nicht gut erforscht, was auf das Fehlen einer standardisierten Methode zur Isolierung von SVF aus PVAT zurückzuführen ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus Maus-PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, zu etablieren und so eine weitere Untersuchung der PVAT-Funktion zu ermöglichen. Dieses Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierungstechniken für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten, die aus jungen Mäusen gewonnen wurden.

Protocol

Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Chest Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist (Zulassungsnummer: KS23010) und entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen sind für dieses Experiment zu bevorzugen. 1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Puffern und Nährmedien Chirurgische Instru…

Representative Results

Mit diesem oben beschriebenen Protokoll haben wir sorgfältig PVATs isoliert, die die thorakalen Aorten der Maus umgeben (Abbildung 1A-D). Nach dem Waschen und Zerkleinern der PVATs in kleine Stücke mit einer sterilen Schere (Abbildung 1E,F) wurden die Gewebefragmente in einer Aufschlusslösung, die Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) enthielt, aufgeschlossen und bei 37 °C auf einem Schüttler für 30-45 Minuten inkubiert …

Discussion

Wir schlagen einen praktischen und praktikablen Ansatz für die Isolierung und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe der Maus vor. Die Vorteile dieses Protokolls sind, dass es einfach und kostengünstig ist. Eine ausreichende Anzahl von Mäusen ist entscheidend für eine erfolgreiche Isolierung, da unzureichendes Gewebe zu einer niedrigen SVF-Dichte und einem schlechten Wachstumszustand führen kann, was letztendlich die lipogene Effizienz beeinträchtigt. Darüber hinaus ist…

Materials

0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001