Summary

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.

Abstract

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT) היא מחסן רקמת שומן המקיף כלי דם ומציג את הפנוטיפים של אדיפוציטים לבנים, בז’ וחומים. תגליות אחרונות שפכו אור על התפקיד המרכזי של PVAT בוויסות הומאוסטזיס כלי הדם והשתתפות בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. הבנה מקיפה של תכונות PVAT ורגולציה היא בעלת חשיבות רבה לפיתוח טיפולים עתידיים. תרביות ראשוניות של אדיפוציטים פריאורטיים הן בעלות ערך לחקר תפקוד PVAT וההצלבה בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי כלי דם. מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני וישים לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם במקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר, אשר יכול להיות שימושי למידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה במבחנה. הפרוטוקול מתאר עיבוד רקמות והתמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים מעכברים צעירים. פרוטוקול זה יספק את אבן הפינה הטכנולוגית בצד הספסל לחקירת תפקוד PVAT.

Introduction

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT), מבנה פריווסקולרי המורכב מתערובת של אדיפוציטים בוגרים ומקטע כלי דם סטרומה (SVF), הוא האמין אינטראקציה עם דופן כלי הדם הסמוך באמצעות ההפרשה שלהparacrineally 1. כמווסת קריטי של הומאוסטזיס כלי דם, תפקוד לקוי של PVAT מעורב בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם 2,3,4. SVF של רקמת השומן מורכב ממספר אוכלוסיות תאים צפויות, כולל תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי מזותליום, תאים עצביים ותאי גזע ותאי אב שומניים (ASPCs)5,6. ידוע היטב כי ASPCs השוכנים ב- SVF של רקמת השומן יכולים להצמיח אדיפוציטים בוגרים5. SVF מוסק להיות מקור קריטי של אדיפוציטים בוגרים PVAT. מספר מחקרים הראו כי PVAT-SVF יכול להתמיין לאדיפוציטים בוגרים בתנאי אינדוקציה ספציפיים 6,7,8.

כיום קיימות שתי מערכות בידוד לבידוד SVF מרקמת השומן, האחת היא עיכול אנזימטי והשנייה אינה אנזימטית9. שיטות אנזימטיות בדרך כלל מביאות לתשואה גבוהה יותר של תאי אב בעלי גרעין10. עד כה, היתרונות של SVF בקידום התחדשות כלי הדם וניאו-וסקולריזציה בריפוי פצעים, מחלות אורוגניטליות ומחלות לב וכלי דם הוכחו באופן נרחב11, במיוחד בדרמטולוגיה ובכירורגיה פלסטית12,13. עם זאת, סיכויי היישום הקליני של SVF הנגזר מ- PVAT לא נחקרו היטב, וניתן לייחס זאת להיעדר שיטה סטנדרטית לבידוד SVF מ- PVAT. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס גישה סטנדרטית לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מ-PVAT עכברי סביב אבי העורקים החזי, מה שיאפשר חקירה נוספת של תפקוד PVAT. פרוטוקול זה מייעל את עיבוד רקמות וטכניקות התמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים המתקבלים מעכברים צעירים.

Protocol

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים החזה בשנחאי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (מספר אישור: KS23010) ועמדו בתקנות האתיות הרלוונטיות. יש להעדיף עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בגילאי 4-8 שבועות לניסוי זה. <strong…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה שתואר לעיל, בודדנו בקפידה PVAT סביב אבי העורקים החזי של עכבר (איור 1A-D). לאחר שטיפה וטחינה של PVAT לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטריליים (איור 1E,F), שברי רקמות עוכלו בתמיסת עיכול שהכילה collagenase מסוג 1 (1 מ”ג/מ”ל) ו-dispase II (4 מ”ג/מ”ל) והודגרו …

Discussion

אנו מציעים גישה מעשית וישימה לבידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית של עכבר. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא פשוט וחסכוני. מספר מספיק של עכברים הוא קריטי לבידוד מוצלח, שכן רקמה לא מספקת עלולה לגרום לצפיפות SVF נמוכה ולמצב גדילה ירוד, מה שבסופו של דבר מ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130012 ו -81830010) ופרויקטי טיפוח למחקר בסיסי של בית החולים לחזה בשנחאי (מספר מענק: 2022YNJCQ03).

Materials

0.2 μm syringe filters PALL 4612
12-well plate  Labselect 11210
15 mL centrifuge tube Labserv 310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T-2877 1 nM
50 mL centrifuge tube Labselect CT-002-50A
anti-adiponectin Abcam ab22554 1:1,000 working concentration
anti-COX IV CST 4850 1:1,000 working concentration
anti-FABP4 CST 2120 1:1,000 working concentration
anti-PGC1α Abcam ab191838 1:1,000 working concentration
anti-PPARγ Invitrogen MA5-14889 1:1,000 working concentration
anti-UCP1 Abcam ab10983 1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin CST 6487 1:1,000 working concentration
BSA Beyotime ST023-200g 1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon Falcon 352350
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich C8919
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196 1 mg/mL
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756 1 μM
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G 4 mg/mL
Fetal bovine serum  Gibco 16000-044 10%
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G 20 mM
High glucose DMEM Hyclone SH30022.01
IBMX  Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM
Incubator with orbital shaker Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. LYZ-103B
Insulin (cattle)  Sigma-Aldrich 11070-73-8 1 μM
Isoflurane RWD R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution Pricella  PB180347 protect from light 
Microsurgical forceps Beyotime FS233
Microsurgical scissor Beyotime FS217
Oil Red O  Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd B548117-0500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  115-035-146 1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-035-144 1:5,000 working concentration
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM
Standard forceps Beyotime FS225
Surgical scissor Beyotime FS001

References

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
  3. Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
  4. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  5. Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
  6. Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
  7. Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  8. Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
  9. Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
  10. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
  11. Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
  12. Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
  13. Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
  14. Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
  15. Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
  16. Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
  17. Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
  18. Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
  19. Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
  20. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  21. Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
  22. Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
  23. Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
  24. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  25. Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
  26. Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
  27. Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
  28. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  29. Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
  30. Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).

Play Video

Cite This Article
Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, Y., Cai, Z., He, B. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (197), e65703, doi:10.3791/65703 (2023).

View Video