Summary

Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.

Abstract

Perivasculair vetweefsel (PVAT) is een vetweefseldepot dat de bloedvaten omringt en de fenotypes van witte, beige en bruine vetcellen vertoont. Recente ontdekkingen hebben licht geworpen op de centrale rol van PVAT bij het reguleren van vasculaire homeostase en deelname aan de pathogenese van hart- en vaatziekten. Een uitgebreid begrip van PVAT-eigenschappen en -regulatie is van groot belang voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën. Primaire culturen van periaorta-adipocyten zijn waardevol voor het bestuderen van de PVAT-functie en de overspraak tussen periaorta-adipocyten en vasculaire cellen. Dit artikel presenteert een economisch en haalbaar protocol voor de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, dat nuttig kan zijn voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro. Het protocol schetst weefselverwerking en celdifferentiatie voor het kweken van periaorta-adipocyten van jonge muizen. Dit protocol zal de technologische hoeksteen vormen voor het onderzoek naar de PVAT-functie.

Introduction

Perivasculair vetweefsel (PVAT), een perivasculaire structuur die bestaat uit een mengsel van rijpe adipocyten en een stromale vasculaire fractie (SVF), wordt verondersteldparacriene interactie aan te gaan met de aangrenzende vaatwand via het secretoom1. Als een kritische regulator van vasculaire homeostase is PVAT-disfunctie betrokken bij de pathogenese van hart- en vaatziekten 2,3,4. De SVF van adipocytenweefsel bestaat uit verschillende verwachte celpopulaties, waaronder endotheelcellen, immuuncellen, mesotheelcellen, neuronale cellen en vetstam- en voorlopercellen (ASPC’s)5,6. Het is algemeen bekend dat ASPC’s die zich in de SVF van vetweefsel bevinden, aanleiding kunnen geven tot rijpe adipocyten5. Hieruit wordt afgeleid dat SVF een kritische bron is van rijpe adipocyten in PVAT. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat PVAT-SVF kan differentiëren tot volwassen adipocyten onder specifieke inductieomstandigheden 6,7,8.

Momenteel zijn er twee isolatiesystemen voor het isoleren van SVF uit vetweefsel, de ene is enzymatische vertering en de andere is niet-enzymatisch9. Enzymatische methoden resulteren doorgaans in een hogere opbrengst van kernhoudende voorlopercellen10. Tot op heden zijn de voordelen van SVF bij het bevorderen van vasculaire regeneratie en neovascularisatie bij wondgenezing, urogenitale en hart- en vaatziekten op grote schaal aangetoond11, vooral in de dermatologie en plastische chirurgie12,13. De klinische toepassingsmogelijkheden van PVAT-afgeleide SVF zijn echter niet goed onderzocht, wat kan worden toegeschreven aan het ontbreken van een gestandaardiseerde methode voor de isolatie van SVF uit PVAT. Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde aanpak vast te stellen voor de isolatie, kweek en adipogene inductie van SVF-afgeleide preadipocyten van muizen PVAT rond de thoracale aorta, waardoor verder onderzoek naar de PVAT-functie mogelijk wordt. Dit protocol optimaliseert weefselverwerking en celdifferentiatietechnieken voor het kweken van periaorta-adipocyten verkregen van jonge muizen.

Protocol

De dierprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Shanghai Chest Hospital, aangesloten bij de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (goedkeuringsnummer: KS23010) en waren in overeenstemming met de relevante ethische voorschriften. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen van 4-8 weken oud hebben de voorkeur voor dit experiment. 1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten, buffers en kweekmedia Chirurgisch…

Representative Results

Met behulp van dit hierboven beschreven protocol hebben we zorgvuldig PVAT’s rond thoracale aorta’s van muizen geïsoleerd (Figuur 1A-D). Na het wassen en fijnhakken van de PVAT’s met behulp van een steriele schaar (figuur 1E,F), werden weefselfragmenten verteerd in een digestieoplossing met collagenase type 1 (1 mg/ml) en dispase II (4 mg/ml) en gedurende 30-45 minuten bij 37 °C op een shaker geïncubeerd (figuur 1G</s…

Discussion

We stellen een praktische en haalbare aanpak voor voor de isolatie en adipogene inductie van SVF-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen. De voordelen van dit protocol zijn dat het eenvoudig en voordelig is. Voldoende muizen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle isolatie, omdat onvoldoende weefsel kan leiden tot een lage SVF-dichtheid en een slechte groeitoestand, wat uiteindelijk de lipogene efficiëntie beïnvloedt. Bovendien is de leeftijd van de muis een belangrijke factor om rekening mee …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82130012 en 81830010) en de Nurture-projecten voor fundamenteel onderzoek van het Shanghai Chest Hospital (subsidienummer: 2022YNJCQ03).

Materials

0.2 μm syringe filters PALL 4612
12-well plate  Labselect 11210
15 mL centrifuge tube Labserv 310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T-2877 1 nM
50 mL centrifuge tube Labselect CT-002-50A
anti-adiponectin Abcam ab22554 1:1,000 working concentration
anti-COX IV CST 4850 1:1,000 working concentration
anti-FABP4 CST 2120 1:1,000 working concentration
anti-PGC1α Abcam ab191838 1:1,000 working concentration
anti-PPARγ Invitrogen MA5-14889 1:1,000 working concentration
anti-UCP1 Abcam ab10983 1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin CST 6487 1:1,000 working concentration
BSA Beyotime ST023-200g 1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon Falcon 352350
Collagen from calf skin Sigma-Aldrich C8919
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196 1 mg/mL
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756 1 μM
Dispase II Sigma-Aldrich D4693-1G 4 mg/mL
Fetal bovine serum  Gibco 16000-044 10%
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G 20 mM
High glucose DMEM Hyclone SH30022.01
IBMX  Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM
Incubator with orbital shaker Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. LYZ-103B
Insulin (cattle)  Sigma-Aldrich 11070-73-8 1 μM
Isoflurane RWD R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution Pricella  PB180347 protect from light 
Microsurgical forceps Beyotime FS233
Microsurgical scissor Beyotime FS217
Oil Red O  Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline) Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd B548117-0500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  115-035-146 1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch  111-035-144 1:5,000 working concentration
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM
Standard forceps Beyotime FS225
Surgical scissor Beyotime FS001

References

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
  3. Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
  4. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  5. Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
  6. Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
  7. Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  8. Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
  9. Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
  10. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
  11. Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
  12. Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
  13. Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
  14. Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
  15. Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
  16. Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
  17. Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
  18. Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
  19. Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
  20. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  21. Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
  22. Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
  23. Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
  24. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  25. Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
  26. Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
  27. Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
  28. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  29. Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
  30. Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).

Play Video

Cite This Article
Liang, M., Huang, Y., Jiang, Y., Hu, Y., Cai, Z., He, B. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (197), e65703, doi:10.3791/65703 (2023).

View Video