Основанные на изображениях методы изучения событий мембранного транспорта в клетках устьичной линии
Summary
Здесь представлено несколько широко используемых методов для изучения событий мембранного транспорта рецепторной киназы плазматической мембраны. В этой рукописи подробно описаны протоколы, включающие подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации.
Abstract
В эукариотических клетках мембранные компоненты, включая белки и липиды, пространственно-временные транспортируются к месту назначения в пределах эндомембранной системы. Это включает в себя секреторный транспорт вновь синтезированных белков на поверхность клетки или снаружи клетки, эндоцитарный транспорт внеклеточных грузов или компонентов плазматической мембраны в клетку, а также рециркуляцию или перемещение грузов между субклеточными органеллами и т. д. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации к окружающей среде всех эукариотических клеток и, таким образом, находится под строгим регулированием. Рецепторные киназы клеточной поверхности, воспринимающие сигналы лигандов из внеклеточного пространства, подвергаются как секреторному, так и эндоцитарному транспорту. Здесь описаны широко используемые подходы к изучению событий мембранного транспорта с использованием рецепторной киназы ERL1, локализованной на плазматической мембране. Подходы включают подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации. Для мониторинга пространственно-временной регуляции ERL1 в данном исследовании описывается анализ колокализации между ERL1 и мультивезикулярным белком-маркером тельца, RFP-Ara7, анализ временных рядов этих двух белков и анализ z-стека ERL1-YFP, обработанного ингибиторами мембранного транспорта брефельдином А и вортманнином.
Introduction
Мембранный трафик представляет собой консервативный клеточный процесс, при котором компоненты мембраны (также известные как грузы), включая белки, липиды и другие биологические продукты, распределяются между различными органеллами внутри эукариотической клетки или через плазматическую мембрану во внеклеточноепространство и из него. Этому процессу способствует совокупность мембран и органелл, называемая эндомембранной системой, которая состоит из ядерной мембраны, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, вакуоли/лизосом, плазматической мембраны и множественных эндосом1. Эндомембранная система позволяет модифицировать, упаковывать и транспортировать мембранные компоненты с помощью динамических везикул, которые перемещаются между этими органеллами. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации клеток к окружающей среде и, таким образом, находится под строгим исложным регулированием. В настоящее время разработано и применено множество подходов в молекулярной биологии, химической биологии, микроскопии и масс-спектрометрии, которые значительно продвинули понимание пространственно-временной регуляции эндомембранной системы 3,4. Молекулярная биология используется для классических генетических манипуляций с предполагаемыми игроками, участвующими в мембранном транспорте, таких как изменение экспрессии генов интересующего белка или маркировка интересующего белка определенными метками. Инструменты химической биологии включают использование молекул, которые специфически вмешиваются в движение определенных маршрутов 4,5. Масс-спектрометрия эффективна для идентификации компонентов в органелле, которая была механически выделена биохимическими подходами 3,4. Тем не менее, мембранный трафик является динамичным, разнообразным и сложным биологическимпроцессом1. Для визуализации процесса мембранного транспорта в живых клетках в различных условиях важным инструментом является световая микроскопия. Для преодоления трудностей, связанных с измерением эффективности, кинетики и разнообразия событий, был достигнут непрерывный прогресс в области передовых методов микроскопирования4. В данном исследовании основное внимание уделяется широко распространенным методологиям химической/фармакологической биологии, молекулярной биологии и микроскопии для изучения событий мембранного транспорта в естественно упрощенной и экспериментально доступной системе — процессе развития устьиц.
Устьица представляют собой микропоры на надземных поверхностях растений, которые открываются и закрываются для облегчения газообмена между внутренними клетками и окружающей средой 6,7,8. Следовательно, устьица необходимы для фотосинтеза и транспирации, двух событий, которые имеют решающее значение для выживания и роста растений. Развитие устьиц динамически регулируется сигналами окружающей среды для оптимизации адаптации растения к окружающей среде9. Начиная с исследований 2002 года, идентификация рецепторного белка Too Many Mouths (TMM) открыла дверь в новую эру исследования молекулярных механизмов развития устьиц у модельного растения Arabidopsis thaliana10. Всего через несколько десятилетий был идентифицирован классический сигнальный путь. Этот путь включает в себя группу секреторных пептидных лигандов в семействе факторов формирования эпидермальных паттернов (EFP), несколько киназ рецепторов лейцин-богатых повторами (LRR) на клеточной поверхности в семействе EREECTA (ER), рецепторный белок LRR TMM, каскад MAPK и несколько транскрипционных факторов bHLH, включая SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA и SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Предыдущая работа показала, что одна из рецепторных киназ, ER-LIKE 1 (ERL1), демонстрирует активное субклеточное поведение при восприятии EPF20. ERL2 также динамически перемещается между плазматической мембраной и некоторыми внутриклеточными органеллами27. Блокирование этапов мембранного транспорта вызывает аномальный устьичный рисунок, в результате чего на поверхности листа образуются устьичные скопления28. Эти результаты свидетельствуют о том, что мембранный трафик играет важную роль в развитии устьиц. В данном исследовании описывается протокол пространственно-временного исследования динамики ERL1 с использованием анализа белок-белковой субклеточной колокализации в сочетании с фармакологическим лечением с использованием некоторых ингибиторов мембранного трафика.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эндомембранная система разделяет цитоплазму эукариотической клетки на различные компартменты, что обеспечивает специализированную биологическую функцию этих органелл. Чтобы доставить белки и макромолекулы груза в конечный пункт назначения в нужное время, многочисленные везикулы п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-2217757) (X.Q.) и Университетом медицинских наук Арканзаса (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
