Metodi basati su immagini per studiare eventi di traffico di membrana in cellule di lignaggio stomatico
Summary
Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell’imaging confocale.
Abstract
Nelle cellule eucariotiche, i componenti della membrana, comprese le proteine e i lipidi, vengono trasportati spaziotemporalmente a destinazione all’interno del sistema endomembrana. Ciò include il trasporto secretorio di proteine di nuova sintesi sulla superficie cellulare o all’esterno della cellula, il trasporto endocitico di carichi extracellulari o componenti della membrana plasmatica nella cellula e il riciclaggio o il trasporto di carichi tra gli organelli subcellulari, ecc. Gli eventi di traffico di membrana sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l’adattamento ambientale di tutte le cellule eucariotiche e, quindi, sono sottoposti a una regolamentazione rigorosa. Le chinasi recettoriali della superficie cellulare, che percepiscono i segnali del ligando dallo spazio extracellulare, subiscono sia il trasporto secretorio che quello endocitico. Gli approcci comunemente usati per studiare gli eventi di traffico di membrana utilizzando una chinasi recettoriale ricca di ripetizione leucina localizzata nella membrana plasmatica, ERL1, sono descritti qui. Gli approcci includono la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell’imaging confocale. Per monitorare la regolazione spaziotemporale di ERL1, questo studio descrive l’analisi di co-localizzazione tra ERL1 e una proteina marcatrice del corpo multi-vescicolare, RFP-Ara7, l’analisi delle serie temporali di queste due proteine e l’analisi z-stack di ERL1-YFP trattata con gli inibitori del traffico di membrana brefeldina A e wortmannin.
Introduction
Il traffico di membrana è un processo cellulare conservato che distribuisce componenti di membrana (noti anche come carichi), tra cui proteine, lipidi e altri prodotti biologici, tra diversi organelli all’interno di una cellula eucariotica o attraverso la membrana plasmatica da e verso lo spazio extracellulare1. Questo processo è facilitato da un insieme di membrane e organelli chiamati sistema endomembrana, che consiste nella membrana nucleare, nel reticolo endoplasmatico, nell’apparato di Golgi, nel vacuolo / lisosomi, nella membrana plasmatica e negli endosomi multipli1. Il sistema endomembrana consente la modifica, il confezionamento e il trasporto dei componenti della membrana utilizzando vescicole dinamiche che fanno la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrane sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l’adattamento ambientale delle cellule e, pertanto, sono soggetti a una regolamentazione rigorosa e complessa2. Attualmente, molteplici approcci in biologia molecolare, biologia chimica, microscopia e spettrometria di massa sono stati sviluppati e applicati al campo del traffico di membrana e hanno notevolmente migliorato la comprensione della regolazione spaziotemporale del sistema endomembrana 3,4. La biologia molecolare viene utilizzata per le classiche manipolazioni genetiche dei presunti attori coinvolti nel traffico di membrana, come alterare l’espressione genica della proteina di interesse o etichettare la proteina di interesse con determinati tag. Gli strumenti di biologia chimica includono l’uso di molecole che interferiscono specificamente con il traffico di determinate rotte 4,5. La spettrometria di massa è potente per identificare i componenti in un organello che è stato isolato meccanicamente con approcci biochimici 3,4. Tuttavia, il traffico di membrana è un processo biologico dinamico, diversificato e complesso1. Per visualizzare il processo di traffico di membrana in cellule vive in varie condizioni, la microscopia ottica è uno strumento essenziale. Sono stati fatti continui progressi nelle tecniche avanzate di microscopio per superare le sfide nella misurazione dell’efficienza, della cinetica e della diversità degli eventi4. Qui, questo studio si concentra sulle metodologie ampiamente adottate in biologia chimica / farmacologica, biologia molecolare e microscopia per studiare gli eventi di traffico di membrana in un sistema naturalmente semplificato e sperimentalmente accessibile, il processo di sviluppo stomatico.
Gli stomi sono micropori sulle superfici aeree delle piante che si aprono e si chiudono per facilitare lo scambio di gas tra le cellule interne e l’ambiente 6,7,8. Quindi, gli stomi sono essenziali per la fotosintesi e la traspirazione, due eventi cruciali per la sopravvivenza e la crescita delle piante. Lo sviluppo stomatico viene regolato dinamicamente da segnali ambientali per ottimizzare l’adattamento della pianta all’ambiente circostante9. Risalente a studi nel 2002, l’identificazione della proteina recettore Too Many Mouths (TMM) ha aperto le porte a una nuova era di studio dei meccanismi molecolari dello sviluppo stomatico nella pianta modello Arabidopsis thaliana10. Dopo pochi decenni, è stata identificata una via di segnalazione classica. Da monte a valle, questa via include un gruppo di ligandi peptidici secretori nella famiglia dei fattori di pattern epidermico (EFP), diverse chinasi del recettore LRR (leucine-rich-repeat) della superficie cellulare nella famiglia EREECTA (ER), la proteina del recettore LRR TMM, una cascata MAPK e diversi fattori di trascrizione bHLH tra cui SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA e SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Lavori precedenti indicano che una delle chinasi recettoriali, ER-LIKE 1 (ERL1), dimostra comportamenti subcellulari attivi sulla percezione di EPF20. ERL2 traffica anche dinamicamente tra la membrana plasmatica e alcuni organelli intracellulari27. Il blocco delle fasi di traffico della membrana provoca un pattern stomatico anomalo, con conseguente ammasso stomatico sulla superficie fogliare28. Questi risultati suggeriscono che il traffico di membrana svolge un ruolo essenziale nello sviluppo stomatico. Questo studio descrive un protocollo per studiare spaziotemporalmente le dinamiche ERL1 utilizzando l’analisi di co-localizzazione subcellulare proteina-proteina combinata con un trattamento farmacologico utilizzando alcuni inibitori del traffico di membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema endomembrana separa il citoplasma di una cellula eucariotica in diversi compartimenti, che consente la funzione biologica specializzata di questi organelli. Per consegnare le proteine cargo e le macromolecole alla loro destinazione finale al momento giusto, numerose vescicole sono guidate per fare la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrana altamente regolamentati svolgono un ruolo fondamentale nella vitalità, nello sviluppo e nella crescita delle cellule. Il meccanismo che regola questo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e dal Bronson Foundation Award (H.Z.) dell’Università dell’Arkansas per le scienze mediche (UAMS).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
