Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

Summary

Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

Abstract

Em células eucarióticas, os componentes da membrana, incluindo proteínas e lipídios, são transportados espaço-temporalmente para seu destino dentro do sistema endomembrana. Isso inclui o transporte secretor de proteínas recém-sintetizadas para a superfície celular ou para o exterior da célula, o transporte endocítico de cargas extracelulares ou componentes da membrana plasmática para dentro da célula, e a reciclagem ou transporte de cargas entre as organelas subcelulares, etc. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental de todas as células eucarióticas e, portanto, estão sob regulamentação rigorosa. As quinases dos receptores de superfície celular, que percebem os sinais dos ligantes do espaço extracelular, sofrem transporte secretor e endocítico. Abordagens comumente usadas para estudar os eventos de tráfego de membrana usando uma quinase do receptor de leucina rica em repetição localizada na membrana plasmática, ERL1, são descritas aqui. As abordagens incluem preparação de material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais. Para monitorar a regulação espaço-temporal do ERL1, este estudo descreve a análise de co-localização entre ERL1 e uma proteína marcador de corpo multivesicular, RFP-Ara7, a análise de séries temporais dessas duas proteínas e a análise z-stack de ERL1-YFP tratadas com os inibidores de tráfego de membrana brefeldina A e wortmannina.

Introduction

O tráfego de membranas é um processo celular conservado que distribui componentes da membrana (também conhecidos como cargas), incluindo proteínas, lipídios e outros produtos biológicos, entre diferentes organelas dentro de uma célula eucariótica ou através da membrana plasmática de e para o espaço extracelular¹. Esse processo é facilitado por uma coleção de membranas e organelas denominada sistema endomembrana, que consiste na membrana nuclear, no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi, no vacúolo/lisossomos, na membrana plasmática e em múltiplos endossomos¹. O sistema de endomembrana permite a modificação, empacotamento e transporte de componentes da membrana usando vesículas dinâmicas que transitam entre essas organelas. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental das células e, portanto, estão sob regulação rigorosa e complexa². Atualmente, múltiplas abordagens em biologia molecular, biologia química, microscopia e espectrometria de massas têm sido desenvolvidas e aplicadas ao campo do tráfego de membranas e têm avançado muito o entendimento da regulação espaço-temporal do sistema endomembrana3,4. A biologia molecular é usada para manipulações genéticas clássicas dos possíveis atores envolvidos no tráfico de membranas, como alterar a expressão gênica da proteína de interesse ou rotular a proteína de interesse com certas etiquetas. Ferramentas em biologia química incluem o uso de moléculas que interferem especificamente no tráfego de determinadas rotas ^4,5. A espectrometria de massas é poderosa para identificar os componentes de uma organela que foi isolada mecanicamente por abordagens bioquímicas ^3,4. No entanto, o tráfego de membranas é um processo biológico dinâmico, diversificado e complexo¹. Para visualizar o processo de tráfego de membranas em células vivas sob várias condições, a microscopia de luz é uma ferramenta essencial. Progressos contínuos têm sido feitos em técnicas avançadas de microscópio para superar os desafios na medição da eficiência, cinética e diversidade dos eventos⁴. Aqui, este estudo se concentra nas metodologias amplamente adotadas em biologia química/farmacológica, biologia molecular e microscopia para estudar eventos de tráfego de membranas em um sistema naturalmente simplificado e experimentalmente acessível, o processo de desenvolvimento estomático.

Estomatas são microporos na superfície aérea das plantas que se abrem e fecham para facilitar as trocas gasosas entre as células internas e o ambiente ^6,7,8. Assim, os estômatos são essenciais para a fotossíntese e transpiração, dois eventos cruciais para a sobrevivência e crescimento das plantas. O desenvolvimento estomático é ajustado dinamicamente por pistas ambientais para otimizar a adaptação da planta ao entorno⁹. Remontando a estudos realizados em 2002, a identificação da proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abriu as portas para uma nova era de investigação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento estomático na planta-modelo Arabidopsis thaliana¹⁰. Após apenas algumas décadas, uma via de sinalização clássica foi identificada. De montante para jusante, essa via inclui um grupo de ligantes peptídicos secretores na família dos fatores de padronização epidérmica (EFP), várias quinases de receptores de repetição rica em leucina (LRR) de superfície celular da família EREECTA (ER), a proteína TMM do receptor LRR, uma cascata MAPK e vários fatores de transcrição bHLH, incluindo SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, e SCREAM (SCRM)^11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabalhos anteriores indicam que uma das quinases receptoras, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstra comportamentos subcelulares ativos sobre a percepção do PFE²⁰. O ERL2 também trafega dinamicamente entre a membrana plasmática e algumas organelas intracelulares²⁷. O bloqueio das etapas de tráfego da membrana causa padrões estomáticos anormais, resultando em aglomerados estomáticos na superfície foliar²⁸. Estes resultados sugerem que o tráfego de membranas desempenha um papel essencial no desenvolvimento estomático. Este estudo descreve um protocolo para investigar espaço-temporalmente a dinâmica do ERL1 usando análise de co-localização subcelular proteína-proteína combinada com tratamento farmacológico usando alguns inibidores do tráfego de membrana.

Protocol

1. Preparação das soluções Preparar a solução de esterilização de sementes misturando 15 mL de água sanitária com 35 mL de água destilada e 50 μL de Triton X-100. Preparar a solução de brefeldina A (BFA) dissolvendo o pó de BFA em etanol até uma concentração final de 10 mM (stock). Preparar a solução de wortmannin (Wm) dissolvendo o pó de Wm em DMSO até uma concentração final de 10 mM (stock). 2. Semeando as sementes</str…

Representative Results

Um estudo anterior indicou que ERL1 é um receptor quinase ativo que sofre eventos dinâmicos de tráfego de membrana20. ERL1 é uma quinase transmembrana do receptor LRR na membrana plasmática. O ERL1 recém-sintetizado no retículo endoplasmático é processado nos corpos de Golgi e posteriormente transportado para a membrana plasmática. As moléculas de ERL1 na membrana plasmática podem perceber ligantes de FPE usando seu domínio LRR extracelular18. Após a ativaçã…

Discussion

O sistema de endomembrana separa o citoplasma de uma célula eucariótica em diferentes compartimentos, o que possibilita a função biológica especializada dessas organelas. Para entregar proteínas de carga e macromoléculas ao seu destino final no momento certo, inúmeras vesículas são guiadas para transportar entre essas organelas. Eventos de tráfico de membrana altamente regulados desempenham papéis fundamentais na viabilidade, desenvolvimento e crescimento das células. O mecanismo que regula esse processo cru…

Materials

10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug