שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית
Summary
מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.
Abstract
בתאים אאוקריוטים, מרכיבי הממברנה, כולל חלבונים ושומנים, מועברים באופן מרחבי-זמני ליעדם בתוך מערכת האנדוממברנה. זה כולל הובלה הפרשה של חלבונים מסונתזים חדשים אל פני התא או אל מחוץ לתא, הובלה אנדוציטית של מטענים חוץ-תאיים או רכיבי קרום פלזמה לתוך התא, והובלה מיחזור או העברה של מטענים בין האברונים התת-תאיים וכו’. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות, צמיחה והסתגלות סביבתית של כל התאים האיקריוטים, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה. קינאזות קולטן פני השטח של התא, אשר קולטות אותות ליגנד מהמרחב החוץ-תאי, עוברות הן הובלה הפרשה והן הובלה אנדוציטית. גישות נפוצות לחקר אירועי סחר בממברנות באמצעות קינאז קולטן לאוצין עשיר בחזרת פלזמה, ERL1, מתוארות כאן. הגישות כוללות הכנת חומר צמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית. כדי לעקוב אחר הוויסות המרחבי-זמני של ERL1, מחקר זה מתאר את ניתוח הלוקליזציה המשותפת בין ERL1 לבין חלבון סמן גוף רב-שלפוחיתי, RFP-Ara7, ניתוח סדרות הזמן של שני חלבונים אלה, וניתוח מחסנית z של ERL1-YFP שטופל במעכבי סחר בקרום ברפלדין A וורטמנין.
Introduction
תנועת ממברנות היא תהליך תאי שמור המפיץ רכיבי ממברנה (הידועים גם בשם מטענים), כולל חלבונים, שומנים ומוצרים ביולוגיים אחרים, בין אברונים שונים בתוך תא אאוקריוטי או על פני קרום הפלזמה אל החלל החוץ תאי וממנו1. תהליך זה מתאפשר על ידי אוסף של ממברנות ואברונים הנקראים מערכת האנדוממברנה, המורכבת מקרום הגרעין, הרשתית האנדופלסמית, מנגנון גולג’י, החללית / ליזוזומים, קרום הפלזמה ואנדוזומים מרובים1. מערכת האנדוממברנה מאפשרת שינוי, אריזה ושינוע של רכיבי הממברנה באמצעות שלפוחיות דינמיות העוברות בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות תאים, גדילה והסתגלות סביבתית, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה ומורכבת2. כיום, גישות רבות בביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה כימית, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסות פותחו ויושמו בתחום הסחר בממברנות וקידמו מאוד את ההבנה של הוויסות המרחבי-זמני של מערכת האנדוממברנה 3,4. ביולוגיה מולקולרית משמשת למניפולציות גנטיות קלאסיות של שחקנים פוטנציאליים המעורבים בסחר בממברנה, כגון שינוי ביטוי הגנים של החלבון המעניין או תיוג החלבון המעניין בתגים מסוימים. כלים בביולוגיה כימית כוללים שימוש במולקולות המפריעות באופן ספציפי לתנועה של נתיבים מסוימים 4,5. ספקטרומטריית מסות היא רבת עוצמה לזיהוי הרכיבים באברון שבודד מכנית על ידי גישות ביוכימיות 3,4. עם זאת, תנועת הממברנות היא תהליך ביולוגי דינמי, מגוון ומורכב1. כדי להמחיש את תהליך הסחר בקרום בתאים חיים בתנאים שונים, מיקרוסקופ אור הוא כלי חיוני. התקדמות מתמדת נעשתה בטכניקות מיקרוסקופ מתקדמות כדי להתגבר על האתגרים במדידת היעילות, הקינטיקה והמגוון של האירועים4. כאן, מחקר זה מתמקד במתודולוגיות המקובלות בביולוגיה כימית/פרמקולוגית, ביולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופ לחקר אירועי סחר בממברנות במערכת פשוטה ונגישה באופן טבעי, תהליך ההתפתחות הסטומטאלי.
סטומטות הן מיקרו-נקבוביות על משטחים אוויריים של צמחים שנפתחים ונסגרים כדי להקל על חילופי הגזים בין התאים הפנימיים לסביבה 6,7,8. לפיכך, הפיוניות חיוניות לפוטוסינתזה ולטרנספירציה, שני אירועים חיוניים להישרדות הצמח ולצמיחתו. התפתחות סטומטית מותאמת באופן דינמי על ידי רמזים סביבתיים כדי לייעל את הסתגלות הצמח לסביבה9. זיהוי חלבון הקולטן Too Many Mouths (TMM), שראשיתו במחקרים בשנת 2002, פתח את הדלת לעידן חדש של חקירת המנגנונים המולקולריים של התפתחות סטומטית בצמח המודל Arabidopsis thaliana10. לאחר כמה עשורים בלבד, זוהה מסלול איתות קלאסי. ממעלה הזרם אל במורד הזרם, מסלול זה כולל קבוצה של ליגנדות פפטידים מפרישים ממשפחת גורמי דפוס האפידרמיס (EFP), מספר קינאזות קולטן לאוצין עשיר בחוזר (LRR) ממשפחת EREECTA (ER), חלבון קולטן LRR TMM, מפל MAPK, וכמה גורמי שעתוק bHLH כולל SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA וצעקה (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. עבודות קודמות מצביעות על כך שאחת הקינאזות של הקולטן, ER-LIKE 1 (ERL1), מדגימה התנהגויות תת-תאיות פעילות בתפיסת EPF20. ERL2 גם נע באופן דינמי בין קרום הפלזמה לבין כמה אברונים תוך-תאיים27. חסימת שלבי תנועת הממברנות גורמת לדפוס סטומטלי לא תקין, וכתוצאה מכך נוצרים אשכולות סטומטיים על פני העלה28. תוצאות אלה מצביעות על כך שתעבורת הממברנות ממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות סטומטלית. מחקר זה מתאר פרוטוקול לחקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות ניתוח לוקליזציה תת-תאית של חלבון-חלבון בשילוב עם טיפול תרופתי באמצעות כמה מעכבי סחר בממברנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת האנדוממברנה מפרידה את הציטופלסמה של התא האיקריוטי לתאים שונים, מה שמאפשר את התפקוד הביולוגי המיוחד של אברונים אלה. כדי להעביר חלבוני מטען ומקרומולקולות ליעדם הסופי בזמן הנכון, שלפוחיות רבות מונחות לעבור בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות מוסדרים מאוד ממלאים תפקידים בסיסיים בכדא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-2217757) (X.Q.) ופרס קרן ברונסון של אוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (UAMS) (H.Z).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
