Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique
Summary
Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.
Abstract
Dans les cellules eucaryotes, les composants membranaires, y compris les protéines et les lipides, sont transportés spatio-temporellement vers leur destination dans le système endomembranaire. Cela comprend le transport sécrétoire de protéines nouvellement synthétisées à la surface cellulaire ou à l’extérieur de la cellule, le transport endocytaire de cargaisons extracellulaires ou de composants de membrane plasmique dans la cellule, et le recyclage ou le transport de navettes entre les organites subcellulaires, etc. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement, la croissance et l’adaptation environnementale de toutes les cellules eucaryotes et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte. Les kinases réceptrices de surface cellulaire, qui perçoivent les signaux de ligand de l’espace extracellulaire, subissent à la fois un transport sécrétoire et endocytaire. Les approches couramment utilisées pour étudier les événements de trafic membranaire à l’aide d’une kinase à récepteurs riches en leucine et à répétition localisée par membrane plasmique, ERL1, sont décrites ici. Les approches comprennent la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale. Pour surveiller la régulation spatio-temporelle d’ERL1, cette étude décrit l’analyse de co-localisation entre ERL1 et une protéine marqueur corporel multi-vésiculaire, RFP-Ara7, l’analyse de séries chronologiques de ces deux protéines et l’analyse z-stack d’ERL1-YFP traitées avec les inhibiteurs du trafic membranaire brefeldin A et wortmannin.
Introduction
Le trafic membranaire est un processus cellulaire conservé qui distribue les composants membranaires (également appelés cargaisons), y compris les protéines, les lipides et d’autres produits biologiques, entre différents organites au sein d’une cellule eucaryote ou à travers la membrane plasmique vers et depuis l’espace extracellulaire1. Ce processus est facilité par une collection de membranes et d’organites appelée système endomembranaire, qui comprend la membrane nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les vaculoles/lysosomes, la membrane plasmique et de multiples endosomes1. Le système endomembranaire permet la modification, l’emballage et le transport des composants membranaires à l’aide de vésicules dynamiques qui font la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement cellulaire, la croissance et l’adaptation environnementale et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte et complexe2. Actuellement, de multiples approches en biologie moléculaire, en biologie chimique, en microscopie et en spectrométrie de masse ont été développées et appliquées au domaine du trafic membranaire et ont grandement fait progresser la compréhension de la régulation spatio-temporelle du système endomembranaire 3,4. La biologie moléculaire est utilisée pour les manipulations génétiques classiques des acteurs présumés impliqués dans le trafic membranaire, telles que la modification de l’expression génique de la protéine d’intérêt ou l’étiquetage de la protéine d’intérêt avec certaines étiquettes. Les outils en biologie chimique comprennent l’utilisation de molécules qui interfèrent spécifiquement avec le trafic de certaines routes 4,5. La spectrométrie de masse est puissante pour identifier les composants d’un organite qui a été isolé mécaniquement par des approches biochimiques 3,4. Cependant, le trafic membranaire est un processus biologique dynamique, diversifié et complexe1. Pour visualiser le processus de trafic membranaire dans les cellules vivantes dans diverses conditions, la microscopie optique est un outil essentiel. Des progrès continus ont été réalisés dans les techniques de microscope avancées pour surmonter les défis liés à la mesure de l’efficacité, de la cinétique et de la diversité des événements4. Ici, cette étude se concentre sur les méthodologies largement adoptées en biologie chimique / pharmacologique, en biologie moléculaire et en microscopie pour étudier les événements de trafic membranaire dans un système naturellement simplifié et accessible expérimentalement, le processus de développement stomatique.
Les stomates sont des micropores sur les surfaces aériennes des plantes qui s’ouvrent et se ferment pour faciliter les échanges gazeux entre les cellules internes et l’environnement 6,7,8. Par conséquent, les stomates sont essentiels à la photosynthèse et à la transpiration, deux événements cruciaux pour la survie et la croissance des plantes. Le développement stomatique est ajusté dynamiquement par des indices environnementaux afin d’optimiser l’adaptation de la plante à l’environnement9. Datant d’études de 2002, l’identification de la protéine réceptrice Too Many Mouths (TMM) a ouvert la porte à une nouvelle ère d’étude des mécanismes moléculaires du développement stomatique chez la plante modèle Arabidopsis thaliana10. Après seulement quelques décennies, une voie de signalisation classique a été identifiée. De l’amont vers l’aval, cette voie comprend un groupe de ligands peptidiques sécrétoires de la famille des facteurs de structuration épidermique (EFP), plusieurs kinases des récepteurs LRR (Leucine-Rich-Repeat) à la surface cellulaire de la famille EREECTA (ER), la protéine réceptrice LRR TMM, une cascade MAPK et plusieurs facteurs de transcription bHLH, notamment SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA et SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Des travaux antérieurs indiquent que l’un des récepteurs kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), démontre des comportements subcellulaires actifs lors de la perception EPF20. ERL2 circule également dynamiquement entre la membrane plasmique et certains organites intracellulaires27. Le blocage des étapes de trafic membranaire provoque une structuration stomatique anormale, entraînant des grappes stomatiques à la surface des feuilles28. Ces résultats suggèrent que le trafic membranaire joue un rôle essentiel dans le développement stomatique. Cette étude décrit un protocole pour étudier spatio-temporellement la dynamique ERL1 en utilisant une analyse de colocalisation sous-cellulaire protéine-protéine combinée à un traitement pharmacologique utilisant certains inhibiteurs du trafic membranaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système endomembranaire sépare le cytoplasme d’une cellule eucaryote en différents compartiments, ce qui permet la fonction biologique spécialisée de ces organites. Pour livrer les protéines et les macromolécules de cargaison à leur destination finale au bon moment, de nombreuses vésicules sont guidées pour faire la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire hautement réglementés jouent un rôle fondamental dans la viabilité, le développement et la croissance des cellules. Le m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) et le prix de la Fondation Bronson (H.Z.) de l’Université de l’Arkansas pour les sciences médicales (UAMS).
Materials
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. . Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
