Summary

Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).

Abstract

La respuesta inflamatoria causada por la lesión pulmonar temprana es una de las causas importantes del desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), que se acompaña de la activación de células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, así como la liberación de factores inflamatorios como TNF-α, IL-1β e IL-6. Se sabe que la inflamación temprana causada por macrófagos intersticiales pulmonares (IM) activados en respuesta a la estimulación de IL-33 desempeña un papel vital en el proceso patológico de la FPI. Este protocolo describe la transferencia adoptiva de IMs estimulados por IL-33 a los pulmones de ratones para estudiar el desarrollo de FPI. Implica el aislamiento y cultivo de MI primarios de pulmones de ratón huésped, seguido de la transferencia adoptiva de MI estimulados a los alvéolos de ratones receptores de FPI inducidos por bleomicina (BLM) (que han sido previamente agotados de macrófagos alveolares por tratamiento con liposomas clodronatos), y la evaluación patológica de esos ratones. Los resultados representativos muestran que la transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava la fibrosis pulmonar en ratones, lo que sugiere que el establecimiento del experimento de transferencia adoptiva de macrófagos es un buen medio técnico para estudiar la patología de la FPI.

Introduction

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad inflamatoria pulmonar difusa causada por muchos factores1. En el microambiente de citoquinas de la respuesta inmune Th1 y Th2, los macrófagos pueden polarizarse en macrófagos activados clásicamente (M1) y macrófagos activados alternativamente (M2). Los lipopolisacáridos (LPS) o la citoquina IFN-γ inducen a los macrófagos M1 a polarizarse y producir citoquinas proinflamatorias, incluyendo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. En contraste, las citoquinas tipo II IL-4 e IL-13 impulsan la polarización de los macrófagos M2, que pueden producir diferentes factores promotores del crecimiento de fibroblastos, como TGF-β y PDGF, que promueven la fibrosis pulmonar2. El proceso patológico de la FPI se acompaña de activación e infiltración de macrófagos. La FPI media la reparación de lesiones, la inflamación y la fibrosis a través de la liberación de citoquinas3. Como solo se dispone de opciones terapéuticas limitadas, explorar los mecanismos patológicos moleculares de la FPI tiene gran importancia para desarrollar nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de la FPI. Estudios previos realizados por nuestro grupo y otros investigadores 4,5 han confirmado el aumento de la liberación de IL-33 en pacientes con FPI y en modelos de ratón con FPI inducida por bleomicina (BLM). La IL-33 es liberada por las células epiteliales y endoteliales durante la fibrosis y está involucrada en la activación de macrófagos, lo que resulta en la proliferación anormal de fibroblastos, la infiltración de leucocitos y la eventual pérdida de la función pulmonar5. El protocolo actual describe la transferencia adoptiva de macrófagos intersticiales (IM) estimulados por IL-33 en los alvéolos como un medio para estudiar el desarrollo de FPI en modelos de ratón. Aquí, los IM se aislaron del tejido pulmonar de ratones huéspedes, se cultivaron in vitro, se estimularon con IL-33 durante 24 h y luego se transfirieron adoptivamente a los alvéolos de los ratones receptores mediante inyección traqueal. Se encontró que la recolección directa de macrófagos de ratón estimulados y su transferencia adoptiva a los alvéolos receptores agrava el grado de fibrosis pulmonar y puede ilustrar más claramente la influencia de los factores estimulantes en la fibrosis en comparación con los estudios previos6. La técnica descrita en este documento puede permitir a los investigadores explorar la función de los macrófagos estimulados por citoquinas potenciales en el desarrollo de la FPI.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar Animal Experimental de la Universidad de Jiangnan (JN No. 20211130m1720615[501]). NOTA: En total, se utilizaron 10 ratones machos C57BL / 6 de 6-8 semanas de edad y con un peso de 20-25 g en este estudio. Los tres grupos experimentales en el estudio incluyeron tres ratones receptores …

Representative Results

El protocolo utilizado aquí se resume en el diagrama de flujo de la Figura 1. La inhalación de liposomas de clodronato a través de la nariz (Figura 2) se utilizó para agotar los macrófagos pulmonares de ratones adultos C57BL / 6, y esto produjo un buen modelo de ratón receptor. Los IM pulmonares se aislaron de otro ratón no tratado (huésped) (Figura 3A, B) y se cultivaron in vitro. Los macrófagos …

Discussion

Este estudio proporciona un método eficaz para agotar, aislar, cultivar y transferir macrófagos, lo que puede ayudar a estudiar los mecanismos de la fibrosis pulmonar en ratones. Existen muchos métodos para el agotamiento de macrófagos en ratones, como la administración traqueal, la inyección de venas de la cola y la inhalación nasal11. Este estudio optimizó el método de inhalación nasal, que es fácil de operar y puede agotar eficazmente los macrófagos pulmonares</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen el tema especial de gestión de laboratorio de la Universidad de Jiangnan: construcción de una biblioteca digital basada en muestras patológicas (JDSYS202223) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81800065).

Materials

 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

References

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Cite This Article
Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

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