Summary

Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Этот протокол описывает выделение легочных интерстициальных макрофагов (ИМ) и их адоптивный перенос после стимуляции IL-33 альвеол легких на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза (IPF) in vivo .

Abstract

Воспалительная реакция, вызванная ранним повреждением легких, является одной из важных причин развития идиопатического легочного фиброза (ИЛФ), который сопровождается активацией воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, а также высвобождением воспалительных факторов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. Известно, что раннее воспаление, вызванное активированными легочными интерстициальными макрофагами (ИМ) в ответ на стимуляцию IL-33, играет жизненно важную роль в патологическом процессе IPF. Этот протокол описывает адоптивный перенос IM, стимулированных IL-33, в легкие мышей для изучения развития IPF. Он включает в себя выделение и культивирование первичных IM из легких мыши-хозяина с последующим приемным переносом стимулированных IM в альвеолы мышей-реципиентов IPF, индуцированных блеомицином (BLM) (которые ранее были истощены альвеолярными макрофагами путем лечения клодронатными липосомами) и патологическую оценку этих мышей. Репрезентативные результаты показывают, что адоптивный перенос макрофагов, стимулированных IL-33, усугубляет легочный фиброз у мышей, что позволяет предположить, что проведение эксперимента по адоптивному переносу макрофагов является хорошим техническим средством для изучения патологии IPF.

Introduction

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) – это диффузное воспалительное заболевание легких, вызванное многими факторами1. В цитокиновом микроокружении иммунного ответа Th1 и Th2 макрофаги могут быть поляризованы на классически активированные макрофаги (M1) и альтернативно активированные макрофаги (M2). Липополисахариды (ЛПС) или цитокин ИФН-γ индуцируют макрофаги М1 поляризоваться и продуцировать провоспалительные цитокины, включая iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α и IL-12. Напротив, цитокины II типа IL-4 и IL-13 управляют поляризацией макрофагов M2, которые могут продуцировать различные факторы, стимулирующие рост фибробластов, такие как TGF-β и PDGF, которые способствуют легочному фиброзу2. Патологический процесс ИЛФ сопровождается активацией и инфильтрацией макрофагов. IPF опосредует восстановление травмы, воспаление и фиброз за счет высвобождения цитокинов3. Поскольку доступны лишь ограниченные терапевтические возможности, изучение молекулярных патологических механизмов ИЛФ имеет большое значение для разработки новых стратегий профилактики и лечения ИЛФ. Предыдущие исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями 4,5, подтвердили повышенное высвобождение IL-33 у пациентов с IPF и на мышиных моделях с блеомицином (BLM)-индуцированным IPF. IL-33 высвобождается эпителиальными и эндотелиальными клетками во время фиброза и участвует в активации макрофагов, что приводит к аномальной пролиферации фибробластов, инфильтрации лейкоцитов и, в конечном итоге, к потере функции легких5. Текущий протокол описывает адоптивный перенос IL-33-стимулированных интерстициальных макрофагов (IM) в альвеолы в качестве средства изучения развития IPF на мышиных моделях. Здесь IM выделяли из легочной ткани мышей-хозяев, культивировали in vitro, стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а затем адоптивно переносили в альвеолы мышей-реципиентов путем инъекции в трахею. Было обнаружено, что прямой сбор стимулированных макрофагов мыши и их адаптационный перенос в альвеолы реципиента усугубляет степень легочного фиброза и может более наглядно проиллюстрировать влияние стимулирующих факторов на фиброз по сравнению с предыдущими исследованиями6. Метод, описанный в этой статье, может позволить исследователям изучить функцию макрофагов, стимулируемых потенциальными цитокинами, в развитии IPF.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментального благополучия животных Университета Цзяннань (JN No 20211,130m1720615[501]). ПРИМЕЧАНИ?…

Representative Results

Используемый здесь протокол кратко изложен на блок-схеме на рисунке 1. Вдыхание клодронатных липосом через нос (рис. 2) использовалось для истощения легочных макрофагов взрослых мышей C57BL / 6, и это дало хорошую модель мыши-реципиента. Легочные IM были выдел?…

Discussion

Это исследование предоставляет эффективный метод истощения, изоляции, культивирования и переноса макрофагов, который может помочь в изучении механизмов легочного фиброза у мышей. Существует множество методов истощения макрофагов мыши, таких как введение в трахею, инъекция в хвостову…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают специальную тему управления лабораторией Цзяннаньского университета: создание библиотеки цифровых срезов на основе патологических образцов (JDSYS202223) и Национального фонда естественных наук Китая (81800065).

Materials

 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

References

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
  11. Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

View Video