Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares e sua transferência adotiva após estimulação com IL-33 dos alvéolos pulmonares em modelo murino, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática (FPI).
A resposta inflamatória causada pela lesão pulmonar precoce é uma das causas importantes do desenvolvimento da fibrose pulmonar idiopática (FPI), que é acompanhada pela ativação de células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos, bem como pela liberação de fatores inflamatórios, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Sabe-se que a inflamação precoce causada por macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares ativados em resposta à estimulação com IL-33 desempenha um papel vital no processo patológico da FPI. Este protocolo descreve a transferência adotiva de MIs estimuladas por IL-33 para os pulmões de camundongos para estudar o desenvolvimento de FPI. Envolve o isolamento e a cultura de MIs primárias de pulmões de camundongos hospedeiros, seguida pela transferência adotiva de MIs estimuladas para os alvéolos de camundongos receptores de FPI induzidos por bleomicina (BLM) (que foram previamente depletados de macrófagos alveolares pelo tratamento com lipossomas clodronatos) e a avaliação patológica desses camundongos. Os resultados representativos mostram que a transferência adotiva de macrófagos estimulados por IL-33 agrava a fibrose pulmonar em camundongos, sugerindo que o estabelecimento do experimento de transferência adotiva de macrófagos é um bom meio técnico para estudar a patologia da FPI.
A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença inflamatória pulmonar difusa causada por váriosfatores1. No microambiente de citocinas da resposta imune Th1 e Th2, os macrófagos podem ser polarizados em macrófagos classicamente ativados (M1) e, alternativamente, macrófagos ativados (M2). Os lipopolissacarídeos (LPS) ou a citocina IFN-γ induzem macrófagos M1 a polarizar e produzir citocinas pró-inflamatórias, incluindo iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Em contraste, as citocinas tipo II IL-4 e IL-13 conduzem a polarização dos macrófagos M2, que podem produzir diferentes fatores promotores de crescimento de fibroblastos, como TGF-β e PDGF, que promovem fibrose pulmonar2. O processo patológico da FPI é acompanhado por ativação e infiltração de macrófagos. A FPI medeia o reparo da lesão, inflamação e fibrose por meio da liberação de citocinas3. Como apenas opções terapêuticas limitadas estão disponíveis, explorar os mecanismos patológicos moleculares da FPI tem grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento da FPI. Estudos prévios realizados por nosso grupo e por outros pesquisadores 4,5 confirmaram o aumento da liberação de IL-33 em pacientes com FPI e em modelos de camundongos com FPI induzida por bleomicina (BLM). A IL-33 é liberada pelas células epiteliais e endoteliais durante a fibrose e está envolvida na ativação de macrófagos, resultando na proliferação anormal de fibroblastos, infiltração leucocitária e eventual perda da função pulmonar5. O protocolo atual descreve a transferência adotiva de macrófagos intersticiais (MIs) estimulados por IL-33 para os alvéolos como um meio de estudar o desenvolvimento de FPI em modelos de camundongos. Aqui, as MIs foram isoladas do tecido pulmonar de camundongos hospedeiros, cultivadas in vitro, estimuladas com IL-33 por 24 h e, em seguida, transferidas adotivamente para os alvéolos de camundongos receptores por injeção traqueal. A coleta direta de macrófagos de camundongos estimulados e sua transferência adotiva para os alvéolos receptores agravou o grau de fibrose pulmonar e pode ilustrar mais claramente a influência dos fatores estimulantes na fibrose em comparação com os estudos anteriores6. A técnica descrita neste trabalho pode permitir que os pesquisadores explorem a função de macrófagos estimulados por potenciais citocinas no desenvolvimento da FPI.
Este estudo fornece um método eficaz para depletar, isolar, cultivar e transferir macrófagos, o que pode ajudar no estudo dos mecanismos de fibrose pulmonar em camundongos. Existem vários métodos para a depleção de macrófagos em camundongos, como administração traqueal, injeção na veia caudal e inalação nasal11. Este estudo otimizou o método de inalação nasal, que é simples de operar e pode efetivamente esgotar macrófagospulmonares 8,9<sup class…
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o Tópico Especial de Gestão de Laboratório da Universidade de Jiangnan: Construção da Biblioteca Digital Slice Baseada em Espécimes Patológicos (JDSYS202223) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81800065).
DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |