Summary

Adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen naar bleomycine-geïnduceerde muismodellen om hun effect op idiopathische longfibrose in vivo te bestuderen

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de isolatie van pulmonale interstitiële macrofagen (IM’s) en hun adoptieve overdracht na IL-33 stimulatie van de longblaasjes in een muismodel, wat de in vivo studie van idiopathische longfibrose (IPF) kan vergemakkelijken.

Abstract

De ontstekingsreactie veroorzaakt door vroege longbeschadiging is een van de belangrijke oorzaken van de ontwikkeling van idiopathische longfibrose (IPF), die gepaard gaat met de activering van ontstekingscellen zoals macrofagen en neutrofielen, evenals de afgifte van ontstekingsfactoren zoals TNF-α, IL-1β en IL-6. Van vroege ontsteking veroorzaakt door geactiveerde pulmonale interstitiële macrofagen (IM’s) als reactie op IL-33-stimulatie is bekend dat ze een vitale rol spelen in het pathologische proces van IPF. Dit protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IM’s gestimuleerd door IL-33 in de longen van muizen om IPF-ontwikkeling te bestuderen. Het omvat de isolatie en kweek van primaire IM’s uit de longen van gastheermuizen, gevolgd door de adoptieve overdracht van gestimuleerde IM’s in de longblaasjes van bleomycine (BLM) -geïnduceerde IPF-ontvangermuizen (die eerder zijn uitgeput van alveolaire macrofagen door behandeling met clodronate liposomen), en de pathologische evaluatie van die muizen. De representatieve resultaten tonen aan dat de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen longfibrose bij muizen verergert, wat suggereert dat de oprichting van het macrofaag adoptieve transferexperiment een goed technisch middel is om IPF-pathologie te bestuderen.

Introduction

Idiopathische longfibrose (IPF) is een diffuse longontstekingsziekte veroorzaakt door vele factoren1. In de cytokine micro-omgeving van de Th1 en Th2 immuunrespons kunnen macrofagen worden gepolariseerd in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) en alternatief geactiveerde macrofagen (M2). Lipopolysacchariden (LPS) of het cytokine IFN-γ induceren M1-macrofagen om te polariseren en pro-inflammatoire cytokines te produceren, waaronder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α en IL-12. Daarentegen drijven de type II-cytokines IL-4 en IL-13 de polarisatie van M2-macrofagen aan, die verschillende fibroblastgroeibevorderende factoren kunnen produceren, zoals TGF-β en PDGF, die longfibrose2 bevorderen. Het pathologische proces van IPF gaat gepaard met macrofaagactivering en infiltratie. IPF bemiddelt letselherstel, ontsteking en fibrose door de afgifte van cytokines3. Omdat er slechts beperkte therapeutische opties beschikbaar zijn, is het verkennen van de moleculaire pathologische mechanismen van IPF van groot belang voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor IPF-preventie en -behandeling. Eerdere studies door onze groep en andere onderzoekers 4,5 hebben de verhoogde afgifte van IL-33 bevestigd bij IPF-patiënten en in muismodellen met bleomycine (BLM)-geïnduceerde IPF. IL-33 wordt vrijgegeven door de epitheel- en endotheelcellen tijdens fibrose en is betrokken bij macrofaagactivatie, wat resulteert in de abnormale proliferatie van fibroblasten, leukocyteninfiltratie en het uiteindelijke verlies van longfunctie5. Het huidige protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde interstitiële macrofagen (IM’s) in de longblaasjes als een middel om IPF-ontwikkeling in muismodellen te bestuderen. Hier werden IM’s geïsoleerd uit het longweefsel van gastheermuizen, in vitro gekweekt, gestimuleerd met IL-33 gedurende 24 uur en vervolgens adoptief overgebracht in de longblaasjes van ontvangende muizen door tracheale injectie. De directe verzameling van gestimuleerde muizenmacrofagen en hun adoptieve overdracht naar de ontvangende longblaasjes bleek de mate van longfibrose te verergeren en kan de invloed van stimulerende factoren op fibrose duidelijker illustreren in vergelijking met de eerdere studies6. De techniek die in dit artikel wordt beschreven, kan onderzoekers in staat stellen om de functie van macrofagen gestimuleerd door potentiële cytokines bij de ontwikkeling van IPF te onderzoeken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenwelzijn van de Jiangnan University (JN nr. 20211,130m1720615[501]). OPMERKING: In totaal werden 10 mannelijke C57BL/6-muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht van 20-25 g gebruikt in deze studie. De drie experimentele groepen in de studie omvatten elk drie ontvangende muizen en één gastheerm…

Representative Results

Het hier gebruikte protocol is samengevat in het stroomdiagram in figuur 1. De inademing van clodronaat liposomen door de neus (figuur 2) werd gebruikt om de pulmonale macrofagen van volwassen C57BL/6 muizen uit te putten, en dit leverde een goed ontvangend muismodel op. Pulmonale IM’s werden geïsoleerd uit een andere onbehandelde (gastheer)muis (figuur 3A,B) en in vitro gekweekt. De geïsoleerde macrofag…

Discussion

Deze studie biedt een effectieve methode om macrofagen uit te putten, te isoleren, te kweken en over te dragen, wat kan helpen bij het bestuderen van de mechanismen van longfibrose bij muizen. Er zijn veel methoden voor macrofaagdepletie bij muizen, zoals tracheale toediening, staartaderinjectie en neusinhalatie11. Deze studie optimaliseerde de nasale inhalatiemethode, die eenvoudig te bedienen is en pulmonale macrofagen effectief kan uitputten 8,9<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen het speciale onderwerp van laboratoriumbeheer van Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) en de National Natural Science Foundation of China (81800065).

Materials

 DMEM Life technologies Biotechnology,USA 1508012
Arterial indwelling needle B Braun Melsingen AG,Germany 21G15G8393
BD Accuri C6 Plus Becton Dickinson,USA
Bleomycin Biotang, USA Ab9465
Carbon dioxide incubator Thermo Forma, USA Thermo Forma370
CD11b R&D Systems,USA 1124F
CD11c R&D Systems,USA N418
Cell culture dish Thermo Forma, USA 174926
Clodronate liposomes  Clodronate liposomes,Netherlands CI-150-150
Collagenase A Sigma-Aldrich, USA 10103578001
F4/80 R&D Systems,USA 521204
Falcon Cell Strainer Becton,Dickinson and Company, USA 352340
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies,USA 1047571
Hematoxylin Eosin  Nanjing Jiancheng Technology,China 06-570
LightCycler 480 PCR detection system Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33 Peprotech, USA 210-33
Nikon microscope Nikon Corporation, Japan 941185
Penicillin, streptomycin Life technologies,USA 877113
Phosphate buffer (PBS) Guangdong Huankai Microbial Technology ,China 1535882
RBC lysis buffer Beyotime Biotechnology Company,China C3702
RNA Isolater Vazyme company,China R401-01-AA Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine Shenzhen Rayward Life Technology ,China R500
Semi-automatic paraffin slicer Leica, Germany LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq Takara, Japan 410800
Trypsin 0.25% Life Technologies, USA 1627172

References

  1. Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
  2. Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
  3. Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
  4. Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
  5. Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
  6. Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
  7. Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
  8. He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
  9. Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
  10. Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
  11. Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
  12. Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
  13. Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
  14. Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhai, X., Li, J., Nie, Y. Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e64742, doi:10.3791/64742 (2023).

View Video